Один канал сотового прилагается патч-зажим записи
Summary
Описанный здесь является процедура получения длинные отрезки текущей записи с одного ионного канала с техникой патч-зажим клеток-прилагается. Этот метод позволяет наблюдать в режиме реального времени, картина открытия-закрытия конформации каналов, лежащих в основе биологического сигнала. Эти данные сообщают о свойствах канала в ненарушенных биологических мембран.
Abstract
Ионный канал белки являются универсальными устройствами для быстрой связи через биологические мембраны. Временной подпись ионного потока они создают зависит от свойств, присущих каждому канального белка, а также механизм, с помощью которой он создан и контролируемым и представляет собой важную область текущих исследований. Информация о оперативных динамики белков ионных каналов могут быть получены путем наблюдения протяженных ток, создаваемый одной молекулы. Описанный здесь это протокол для получения клеток-прилагается патч-зажим текущие записи одного канала для лиганд закрытого ионного канала, рецептора NMDA, выразил гетерологично в НЕК293 или изначально в корковых нейронов. Также предложены инструкции о том, чтобы адаптировать метод к другим ионных каналов, представляющих интерес, представляя пример механо-чувствительных канала PIEZO1. Этот метод может предоставить данные о свойствах проводимости телеканала и временной последовательности ОПЕн-закрытые конформации, которые составляют механизм активации канала, тем самым помогая понять свои функции в норме и патологии.
Introduction
Быстрая связь через биологические мембраны опирается почти исключительно на олигомерных пор формирования мембранных белков, как правило, называют каналами. Эти белки отличаются друг от друга в сигналах активации, механизмов вентильных и свойства проводимости. Белки канала, поры селективный к ионам классифицируются как ионных каналов; их активация производит ионные токи через мембрану, и их ответы могут быть записаны с высоким разрешением в реальном времени с использованием электрофизиологические методы. Сигналы активации охватывают широкий спектр химических и физических входов, включая градиентов концентрации, механических и электрических сил и температуры; Таким образом, дальнейшее классификации ионные каналы в лиганда закрытый, механочувствительных, напряжение закрытого или чувствительные тепловые типы. В этой статье, протоколы описаны записывать активность одноканальный от лиганда закрытого канала, рецептора NMDA, и механочувствительных канала, PIEZO1, используя технику патч-зажим.0;
Патч-зажим электрофизиологии является первым и наиболее широко используется экспериментальный метод достаточно чувствительным, чтобы разрешить наблюдение одиночных молекул 1, 2. В дополнение к этому изысканным чувствительности, это значительно расширены биологические препараты поддающиеся электрофизиологического записи, а также позволило наблюдение ионных каналов в интактных мембран. Во-первых, потому что оба зажима напряжения и тока записи осуществляются с тем же электродом, он может быть использован для записи сигналов через мелких клеток или мембран исправлений. Техника показала, что ионные каналы не ограничиваются возбудимых мембран мышц лягушки, угорь electroplaques или кальмаров гигантских аксонов 3, 4, а то, что они представляют вездесущие светильники механизмов сигнализации трансмембранных и пронизывают все сотовые типов мембранных одно-или многоклеточные организмы, а также внутриклеточных мембран. Импортantly, возможность записывать трансмембранных токов, просто подключая стеклянную пипетку, чтобы неповрежденной клетке при условии, что беспрецедентную возможность для записи активности от ионных каналов в их родных бесперебойное мембран. Таким образом, прилагается методика патч-зажим клеток, который описан в этом протоколе, позволяет мониторинг деятельности ионных каналов непрерывно в течение десятков минут или дольше в их родной среде.
При нормальных тепловых флуктуаций, все белки, в том числе белков ионных каналов, пройти структурные изменения в широком масштабе времени, с самых быстрых и частых перестроек, представленных скорее всего движениями боковых цепей и многое медленных, менее частым изменениям, представленных репозиционирования всей домены или подразделения, или в некоторых случаях изменения посттрансляционных или белок-белковых взаимодействий 5, 6. Наблюдая длительные периоды активности, генерируемые одной молекулы может помочь понять функные динамика ионных каналов в неповрежденных физиологических мембран и дает ценную информацию о рабочем механизме молекулы наблюдается.
В отличие от растущего понимания многообразия ионных каналов по всему типов клеток и этапов развития, знаний о молекулярном составе ионных каналов в родных мембран по-прежнему ограничен. Все ионные каналы являются мультимерные белки и большинство родных ионных каналов собрать из нескольких типов субъединиц, производящих белки широкого молекулярного разнообразия, которое часто сопровождается различными проводимости и вентильных свойств. По этой причине, ионные каналы, определенного молекулярного состава изучены при экспрессии в гетерологичных системах. В частности, клетки HEK293, которые клональное линия иммортализованных эмбриональных клеток почки человека 7, получила широкое признание в качестве предпочтительного системы гетерологичной экспрессии рекомбинантных ионных каналов. Среди человекау преимущества, которые повышенные HEK293 клетки как выбор системы для ионных каналов электрофизиологии являются простота и доступность культивирования и поддержания долгоживущие стабильные культуры, их способность выполнять посттрансляционную складной, обработку и торговлю белков млекопитающих, и во многих случаях , их низкий уровень или даже отсутствие эндогенного выражения для выбранного канала 7, 8. Выражая рекомбинантных ионные каналы и изучения их функциональные свойства в НЕК293 продолжает быть ценным подход для получения информации о структурно-функциональных свойств ионных каналов, а также специфических свойств ионных каналов изоформ и их роли в нативной ткани. Протоколы, описанные в этой статье, могут быть применены в равной степени к рекомбинантным ионных каналов, выраженных в НЕК293 и родных ионных каналов.
Таким образом, методика патч-зажим, через его беспрецедентной производительностью, чтобы решить сигналс от одной молекулы остается, на сегодняшний день, наиболее прямой метод наблюдения за поведением отдельных молекул. В режиме по мобильному подключением, запись патч-зажим позволяет длительные периоды наблюдения, которые, когда сделано для одной молекулы, могут обеспечить исключительное понимание в работе ионных каналов. Ниже представлен протокол для получения текущих записей высокого разрешения от сотовых прикрепленных пластырями, содержащими один белок ионного канала.
Protocol
Representative Results
Discussion
В области ионных каналов, важной областью исследований посвящена пониманию последовательность событий, которая приводит к каналу открытие или механизм стробирования канала. Для большинства каналов, этот процесс является сложным и включает в себя несколько кинетических шаги, которые…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана F31NS086765 (КЭК), F31NS076235 (MAP), и R01 NS052669 (ГКП) и EIA9100012. Авторы выражают благодарность Эйлин Касперек на экспертизу и помощь в области молекулярной биологии и культуре ткани; и Джейсон Майерс для обмена данных, полученных из ранних префронтальной корковых нейронов.
Materials
| Chemicals | Sigma | Various | |
| Borosillicate Glass | Sutter | BF-150-86-10 | |
| Bright field inverted microscope | Olympus | 1×51 | Nikon also has similar microscopes |
| Fluroescent box | X-cite | Series 120 | |
| Liquid Light Guide | X-cite | OEX-LG15 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS1001 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | |
| Table | TMC | 63561 | |
| NIDAQ card | National Instruments | 776844-01 | |
| Puller | Narishige | PC-10 | |
| Polisher | Narishige | Microforge MF-830 | |
| Faraday Cage | TMC | 8133306 | |
| High Speed Pressure Clamp | ALA Scientific Instruments | ALA HSPC | |
| Pressue/Vaccuum Pump | ALA Scientific Instruments | ALA PV-PUMP | For HSPC-1 |
Riferimenti
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Piccolino, M. Animal electricity and the birth of electrophysiology: the legacy of Luigi Galvani. Brain Research Bulletin. 46, 381-407 (1998).
- Albright, T. D., Jessell, T. M., Kandel, E. R., Posner, M. I. Neural Science: A Century of Progress and the Mysteries that Remain. Neuron. 25, (2000).
- Popescu, G. K. Modes of glutamate receptor gating. The Journal of Physiology. 590, 73-91 (2012).
- Morimoto-Tomita, M., et al. Autoinactivation of Neuronal AMPA Receptors via Glutamate-Regulated TARP Interaction. Neuron. 61, 101-112 (2009).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Huang, Z., Li, G., Pei, W., Sosa, L. A., Niu, L. Enhancing protein expression in single HEK 293 cells. Journal of Neuroscience Methods. 142, 159-166 (2005).
- Raymond, L. A., Moshaver, A., Tingley, W. G., Huganir, R. L. Glutamate receptor ion channel properties predict vulnerability to cytotoxicity in a transfected nonneuronal cell line. Mol Cell Neurosci. 7, 102-115 (1996).
- Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97, 738-747 (2009).
- Qin, F. Restoration of single-channel currents using the segmental k-means method based on hidden Markov modeling. Biophys J. 86, 1488-1501 (2004).
- Colquhoun, D., Sigworth, F. J. . chapter in Single-channel recording. 2nd edn eds B. Sakmann and E Neher. , (1995).
- Popescu, G., Auerbach, A. Modal gating of NMDA receptors and the shape of their synaptic response. Nat Neurosci. 6, 476-483 (2003).
- Colquhoun, D., Hawkes, A. G. Stochastic properties of ion channel openings and bursts in a membrane patch that contains two channels: evidence concerning the number of channels present when a record containing only single openings is observed. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 240, 453-477 (1990).
- Kussius, C. L., Kaur, N., Popescu, G. K. Pregnanolone Sulfate Promotes Desensitization of Activated NMDA Receptors. J. Neurosci. 29, 6819-6827 (2009).
- Amico-Ruvio, S., Popescu, G. Stationary gating of GluN1/GluN2B receptors in intact membrane patches. Biophysical Journal. 98, 1160-1169 (2010).
- Borschel, W. F., et al. Gating reaction mechanism of neuronal NMDA receptors. J Neurophysiol. 108, 3105-3115 (2012).
- Colquhoun, D., Hatton, C. J., Hawkes, A. G. The quality of maximum likelihood estimates of ion channel rate constants. The Journal of Physiology. 547, 699-728 (2003).
- Kussius, C. L., Kaur, N., Popescu, G. K. Pregnanolone Sulfate Promotes Desensitization of Activated NMDA Receptors. The Journal of Neuroscience. 29, 6819-6827 (2009).
- Popescu, G., Auerbach, A. Modal gating of NMDA receptors and the shape of their synaptic response. Nat Neurosci. 6, 476-483 (2003).
- Popescu, G., Robert, A., Howe, J. R., Auerbach, A. Reaction mechanism determines NMDA receptor response to repetitive stimulation. Nature. 430, 790-793 (2004).
- Prieto, M. L., Wollmuth, L. P. Gating Modes in AMPA Receptors. The Journal of Neuroscience. 30, 4449-4459 (2010).
- Poon, K., Nowak, L. M., Oswald, R. E. Characterizing Single-Channel Behavior of GluA3 Receptors. Biophysical Journal. 99, 1437-1446 (2010).
- Smith, T. C., Wang, L. -. Y., Howe, J. R. Heterogeneous Conductance Levels of Native AMPA Receptors. The Journal of Neuroscience. 20, 2073-2085 (2000).
- Coste, B., et al. Piezo1 and Piezo2 Are Essential Components of Distinct Mechanically Activated Cation Channels. Science. 330, 55-60 (2010).
- Coste, B., et al. Piezo proteins are pore-forming subunits of mechanically activated channels. Nature. 483, 176-181 (2012).
- Benndorf, K. . chapter in Single-channel recording. 2nd edn eds B. Sakmann and E Neher. , (1995).
