En-kanals Cell-ansluten Patch-clamp inspelning

Summary

Beskrivs här är ett förfarande för att få långa sträckor av aktuell inspelning från en jonkanal med cell bifogade patch-clamp teknik. Denna metod gör det möjligt att observera, i realtid, mönstret av öppen-nära kanalkonformationer som ligger bakom den biologiska signalen. Dessa data informera om kanal fastigheter i ostörda biologiska membran.

Abstract

Jonkanalsproteiner är universella enheter för snabb kommunikation över biologiska membran. Den tidsmässiga underskrift joniska flux de genererar beror på egenskaperna inneboende i varje kanal protein samt den mekanism genom vilken den genereras och kontrolleras och utgör ett viktigt område av aktuell forskning. Information om de operativa dynamik jonkanalproteiner kan erhållas genom observation av långa sträckor av ström som produceras av en enda molekyl. Beskrivet här är ett protokoll för att erhålla en-kanaliga cell bifogade patch-clamp nuvarande inspelningar för en ligand jonkanal, NMDA-receptorn, uttryckt heterologt i HEK293-celler eller inbyggt i kortikala neuroner. Också är instruktioner om hur man ska anpassa metoden till andra jonkanaler av intresse genom att presentera exempel på mekano känsliga kanal PIEZO1. Denna metod kan ge uppgifter om kanalens konduktans egenskaper och den tidssekvens av OPEn-slutna konformationer som utgör kanalens aktiveringsmekanism, vilket bidrar till att förstå deras funktion vid hälsa och sjukdom.

Introduction

Snabb kommunikation över biologiska membran bygger nästan uteslutande på oligomeric por bildar membranproteiner, som vanligtvis kallas kanaler. Dessa proteiner skiljer sig mycket i aktiveringssignaler, grindmekanismer och konduktans egenskaper. Kanal proteiner vars porer är selektiva för joner klassificeras som jonkanaler; deras aktivering producerar jonströmmar över membranet, och deras svar kan spelas in med hög upplösning i realtid med hjälp av elektrofysiologiska metoder. De aktiveringssignaler spänner över ett brett spektrum av kemiska och fysiska ingångar inklusive koncentrationsgradienter, mekaniska och elektriska krafter, och temperatur; alltså, ytterligare klassificera jonkanaler i ligand gated, mechanosensitive, spänning gated, eller värmekänsliga typer. I den här artikeln, är protokoll beskrivs för att spela in en kanal aktivitet från en ligand gated kanal, NMDA-receptorn, och en mechanosensitive kanal, PIEZO1, med hjälp av patch-clamp teknik.0;

Patch-clamp-elektrofysiologi är det första och mest använda experimentella metoden tillräckligt känsligt för att medge observation av enstaka molekyler ^{1, 2.} Förutom denna utsökta känslighet finns det omfattande utökad de biologiska preparat som lämpar sig för elektrofysiologisk registrering och även har tillåtit observationen av jonkanaler i intakta membran. Först, eftersom både spänning fastspänning och ström inspelning åstadkoms med samma elektrod, kan den användas för att spela in signaler över små celler eller membran patchar. Tekniken visade att jonkanaler inte är begränsade till hetsiga membran av groda muskler, ål electroplaques eller bläckfisk jätte axoner ^{3, 4,} utan snarare att de representerar ubiquitous fixturer för transsignaleringsmekanismer och är inneboende i alla cellulära membran typer av uni-eller multicellulära organismer, och även till intracellulära membran. Importoch art, möjlighet att spela in trans strömmar genom att helt enkelt ansluta ett glas pipett till en intakt cell gett helt nya möjligheter att spela in aktivitet från jonkanaler i deras infödda störningsfri membran. Således cellen bifogade patch-clamp teknik, som beskrivs i detta protokoll, tillåter övervakning av aktiviteten av jonkanaler kontinuerligt under tiotals minuter eller längre i sin ursprungliga miljö.

Under normala termiska variationer, alla proteiner, inklusive jonkanalsproteiner, genomgå strukturella förändringar över en bred tidsskala, med de snabbaste och mest frekventa omdisponeringar representerade troligen vid sida-kedja rörelser och mycket långsammare, mindre frekventa förändringar som representeras av ompositionering av hela domäner eller subenheter, eller i vissa fall av posttranslationella modifieringar eller protein-proteininteraktioner ^{5, 6.} Observation långa perioder av verksamhet som genereras av en molekyl kan hjälpa till att förstå funktionentionella dynamiken i jonkanaler i intakta fysiologiska membran och ger värdefull information om det operativa system av molekylen observeras.

I motsats till den ökande förståelsen av mångfalden av jonkanaler över celltyper och utvecklingsstadier, kunskap om den molekylära sammansättningen av jonkanaler i infödda membran är fortfarande begränsad. Alla jonkanaler är multimera proteiner och majoriteten av inhemska jonkanaler ihop från flera typer av subenheter som producerar proteiner med breda molekylära mångfalden, som ofta åtföljs med olika konduktans och gating egenskaper. Av denna anledning är jonkanaler med definierad molekylär sammansättning studerades vid expression i heterologa system. I synnerhet HEK293-celler, som är en klonal linje av immortaliserade humana embryonala njurceller ^7, vunnit bred acceptans som det föredragna systemet för heterolog expression av rekombinanta jonkanaler. Bland manneny fördelar som förhöjda HEK293 celler som valet system för jonkanal elektrofysiologi är den lätthet och överkomliga priser på odling och bibehålla långlivade stabila kulturer, deras förmåga att utföra post-translationell vikning, förädling och handel med däggdjursproteiner, och i många fall , deras låga eller till och med frånvaro av endogen expression för kanal av intresse ^{7, 8.} Att uttrycka rekombinanta jonkanaler och studera deras funktionella egenskaper i HEK293 celler fortsätter att vara en värdefull metod för att få information om struktur-funktionsegenskaper jonkanaler samt specifika egenskaper jonkanal isoformer och deras roller i infödda vävnad. De protokoll som beskrivs i denna artikel kan tillämpas lika väl på rekombinanta jonkanaler som uttrycks i HEK293 celler och infödda jonkanaler.

Sammanfattningsvis, för att patch-clamp teknik, genom sin exempellösa förmåga att lösa signals från en molekyl förblir hittills den mest direkta metoden för att observera beteendet hos enskilda molekyler. I sin cell-anslutna läge, gör patch-clamp inspelning långa observationsperioder som, när det görs för en molekyl, kan ge exceptionell insikt i driften av jonkanaler. Nedan presenteras ett protokoll för att få hög upplösning nuvarande inspelningar från cell bifogade plåster innehållande en jonkanal protein.

Protocol

1. Cellodling och Protein Expression Bibehåll HEK293-celler (ATCC-nummer CRL-1573) mellan passagerna 22 och 40, som omfattar passagerna utförda av ATCC, i monolagerkultur i DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin blandningen vid 5% CO2 och 37 ° C. Mellan experiment, passage celler i T25-kolvar vid 5-20 faldiga späd i en slutlig volym på 10 ml. Anm: Med hjälp av celler under dessa passager garanterar gynnsam cell hälsa som gör det möjligt för op…

Representative Results

Rekombinant NMDA-receptorer NMDA-receptorer binder och svara på den åtföljande handlingen av två co-agonister: glutamat och glycin. De monterar som heterotetramerer av två glycin bindande GluN1 subenheter och två glutamat bindande GluN2 subenheter. GluN2 subenheter kodas av fyra gener (AD) och av dessa de mest transkriberade former i hjärnan är GluN2A i vuxen och GluN2B hos unga djur. På grund av mångfalden av NMDA-receptor subtyper hos infödda beredningar, som ut…

Discussion

I jonkanalen fältet, är ett viktigt forskningsområde tillägnad förstå händelseförlopp som leder till kanalöppningen eller kanalens slussmekanismen. För de flesta kanaler, är processen komplex och involverar flera kinetiska steg som inte kan härledas från en makroskopisk flerkanalig signal. Däremot kan experiment utformas där observera sekvensen av öppna / stängda händelser i en kanal rekord kan producera mer detaljerad information om slussmekanismer. I de metoder som beskrivs här, gör det externt bel…

Materials

Chemicals	Sigma	Various
Borosillicate Glass	Sutter	BF-150-86-10
Bright field inverted microscope	Olympus	1×51	Nikon also has similar microscopes
Fluroescent box	X-cite	Series 120
Liquid Light Guide	X-cite	OEX-LG15
Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-225
Oscilloscope	Tektronix	TDS1001
Amplifier	Molecular Devices	Axon Axopatch 200B
Table	TMC	63561
NIDAQ card	National Instruments	776844-01
Puller	Narishige	PC-10
Polisher	Narishige	Microforge MF-830
Faraday Cage	TMC	8133306
High Speed Pressure Clamp	ALA Scientific Instruments	ALA HSPC
Pressue/Vaccuum Pump	ALA Scientific Instruments	ALA PV-PUMP	For HSPC-1