Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt
Summary
Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.
Abstract
Iyon kanal proteinleri biyolojik zarların üzerinden hızlı iletişim için evrensel cihazlardır. Ürettikleri iyonik akının zamansal imzası her kanal proteini bunun yanı sıra oluşturulur ve kontrol edildiği mekanizma içsel özelliklerine bağlıdır ve güncel araştırma önemli bir alanını temsil eder. Iyon kanalı proteinlerin işlevsel dinamikleri ile ilgili bilgiler, tek bir molekül tarafından üretilen akımın uzun uzanır gözlemleyerek elde edilebilir. Ligand kapılı iyon kanalı, NMDA reseptörü için bir kanalı, hücre bağlı patch-clamp kayıtları akım elde etmek için bir protokol, aşağıda tarif edilmiştir, kortikal nöronlarda HEK293 hücrelerinde doğal olarak ya da heterolog bir şekilde eksprese. Ayrıca mekano duyarlı kanal PIEZO1 örneğini sunarak ilgi diğer iyon kanallarına yöntemi nasıl adapte talimatları vardır sağladı. Bu yöntem, kanal iletkenlik özellikleri ve ope zamansal dizisi ile ilgili verileri sağlayabilirBöylece sağlık ve hastalık onların işlevlerini anlamak için yardımcı kanalın aktivasyon mekanizmasını oluşturan n-kapalı konformasyonlar.
Introduction
Biyolojik zarları arasında hızlı iletişim kanalları yaygın olarak adlandırılan oligomerik gözenek oluşturma membran proteinleri, neredeyse sadece dayanır. Bu proteinler aktivasyon sinyalleri, yolluk mekanizmaları ve iletkenlik özellikleri çok farklıdır. Gözenekleri iyonları seçici kanal proteinleri, iyon kanalları olarak sınıflandırılır; onların aktivasyon zarından iyonik akımları üretir ve bunların yanıtları elektrofizyolojik teknikler kullanarak gerçek zamanlı olarak yüksek çözünürlük ile kaydedilebilir. Aktivasyon sinyalleri konsantrasyon dereceleri, mekanik ve elektrik kuvvetleri, ve sıcaklık gibi kimyasal ve fiziksel girdilerin geniş bir dizi kapsar; Böylece, başka bir bağ içine iyon kanallarını sınıflandırmak, kapı mechanosensitive, voltaj kapılı veya ısıya duyarlı türleri. Bu makalede, protokoller patch-clamp tekniği kullanılarak, bir ligand kapılı kanal, NMDA reseptörü ve bir mechanosensitive kanal PIEZO1 gelen tek kanal aktivitesini kaydetmek için tarif edilmiştir.0;
Patch-clamp elektrofizyoloji tek moleküllerin 1, 2 gözlem izin vermek için yeterince hassas ilk ve en yaygın olarak kullanılan bir deney yöntemidir. Bu zarif hassasiyete ek olarak, bu çok elektrofizyolojik kayıt için uygun biyolojik hazırlıkları genişletilmiş ve aynı zamanda sağlam zarlarında iyon kanallarının gözlem izin verdi. Gerilim ve akım sıkıştırma kaydı hem de aynı elektrot ile gerçekleştirilir, çünkü İlk olarak, bu küçük hücreler ya da zarlar üzerinde yamalar sinyalleri kaydetmek için kullanılabilir. Teknik iyon kanalları kurbağa kasları, yılan balığı electroplaques veya kalamar dev akson 3, 4, ancak bunun yerine transmembran sinyal mekanizmalarının her yerde demirbaş temsil eden ve tek veya her hücresel membran türlerine özgü olan bunun heyecanlı zarlarına sınırlı olmadığını ortaya koydu çok hücreli organizmalar ve aynı zamanda hücre içi zarlarına. Ithalatantly, sadece sağlam bir hücreye bir cam pipet takarak zar akımları kaydetmek için yeteneği kendi ana undisrupted zarlarında iyon kanalları aktivite kayıt için benzersiz bir fırsat sağladı. Böylece, bu protokol açıklanan hücre bağlı patch-clamp tekniği, on dakika ya da doğal bir ortamda uzun bir süre sürekli olarak iyon kanallarının etkinliği izleme izin verir.
Normal termal dalgalanmalardan altında, iyon kanal proteinleri dahil tüm proteinler, yan zincir hareketleri ve bütünün yeniden konumlandırılması tarafından temsil çok daha yavaş, daha az sık değişikliklerden büyük olasılıkla temsil hızlı ve en sık düzenlenmeleri ile, geniş bir zaman ölçeğinde yapısal değişikliklere etki veya alt birimleri veya translasyon sonrası modifikasyon veya protein-protein etkileşimleri 5, 6, bazı durumlarda. Bir molekül tarafından oluşturulan faaliyet uzun süre gözlemleyerek fonk anlamak için yardımcı olabilirtional sağlam fizyolojik zarlarında iyon kanalları dinamikleri ve gözlenen molekülün işletme mekanizması hakkında değerli bilgiler sağlar.
Hücre tipleri ve gelişim aşamaları boyunca iyon kanalları, doğal membran iyon kanallarının moleküler bileşimi hakkında bilgi çeşitliliğinin artan anlaşılması aksine hala sınırlıdır. Tüm iyon kanalları multimerik proteinleri ve doğal iyon kanallarının çoğunluğu genellikle çeşitli iletkenlik ve perdeleme özellikleri ile birlikte olan, geniş moleküler çeşitlilik, proteinleri üretme alt birimlerinin çeşitli türlerinden monte edin. Bu nedenle, tanımlanan terkibin moleküler iyon kanalları heterolog sistemlerde tanımlanması üzerine çalışılmıştır. Özellikle, ölümsüzleştirilmiş insan embriyonik böbrek hücreleri 7 klonal çizgi HEK293 hücreleri, yeniden birleştirici iyon kanallarının heterolog ekspresyonu için tercih edilen bir sistem olarak yaygın bir kabul gördü. Adam arasındaiyon kanal elektrofizyoloji için seçim sistemi olarak HEK293 hücreleri yükselmiş y avantajları kolaylığı ve Kültüre uygun fiyatta ve uzun ömürlü istikrarlı kültürlerini koruyarak, post-translasyon katlama, işleme ve memeli proteinlerinin ticaretini yürütmek için kendi yetenek ve birçok durumda , düşük düzeyde veya ilgi duyulan 7, 8, kanalın endojen ekspresyonunun da olmaması. Rekombinant ifade iyon kanallarını ve HEK293 hücrelerinde fonksiyonel özelliklerini inceleyerek yapı-işlev iyon kanalları özellikleri yanı sıra, bir iyon kanalı izoformları ve doğal doku içinde rolleri spesifik özellikleri hakkında bilgi elde etmek için bir değerli bir yaklaşım olmaya devam etmektedir. Bu makalede açıklanan protokoller HEK293 hücrelerinde eksprese edilen rekombinant iyon kanalları ve yerel iyon kanalları için eşit ölçüde iyi uygulanabilir.
Özetle, onun eşi görülmemiş kapasitesi ile yama kelepçe tekniği, sinyal çözmek içinbir molekülden s, bugüne kadar, tek moleküllerin davranışını gözlemlemek için en doğrudan yöntem olmaya devam etmektedir. Kendi hücre-bağlı modunda, patch-clamp kayıt bir molekül için tamamlandığı zaman, iyon kanallarının devreye olağanüstü bilgi sağlar, uzun gözlem süreleri sağlar. Aşağıda, bir iyon kanalı protein ihtiva eden hücre bağlı yamalar yüksek çözünürlüklü akım kayıtları elde etmek için bir protokol sunulmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Iyon kanalı alanında, araştırma önemli bir alan açılmasını veya kanalın yolluk mekanizmasını kanal açan olaylar dizisini anlamak için adamıştır. En çok kanal için, bu işlem karmaşıktır ve gözle görülebilir çok kanallı sinyalden çıkarılabilir edilemez kinetik çeşitli adımlar içerir. Buna karşılık, deneyler tek kanallı kayıt, açık / kapalı olaylar dizisini gözlemleyerek mekanizmaları yolluk hakkında daha detaylı bilgi üretebilir nerede dizayn edilebilir. Minimal invaziv patc…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma F31NS086765 (KAC) tarafından desteklenen, F31NS076235 (MAP), ve R01 NS052669 (GKP) ve EIA9100012. Yazarlar uzmanlık ve moleküler biyoloji ve doku kültürü ile yardım için Eileen Kasperek teşekkür ediyorum; ve Jason Myers erken prefrontal kortikal nöronların elde edilen veri paylaşımı için.
Materials
| Chemicals | Sigma | Various | |
| Borosillicate Glass | Sutter | BF-150-86-10 | |
| Bright field inverted microscope | Olympus | 1×51 | Nikon also has similar microscopes |
| Fluroescent box | X-cite | Series 120 | |
| Liquid Light Guide | X-cite | OEX-LG15 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-225 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS1001 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Axon Axopatch 200B | |
| Table | TMC | 63561 | |
| NIDAQ card | National Instruments | 776844-01 | |
| Puller | Narishige | PC-10 | |
| Polisher | Narishige | Microforge MF-830 | |
| Faraday Cage | TMC | 8133306 | |
| High Speed Pressure Clamp | ALA Scientific Instruments | ALA HSPC | |
| Pressue/Vaccuum Pump | ALA Scientific Instruments | ALA PV-PUMP | For HSPC-1 |
Riferimenti
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391, 85-100 (1981).
- Piccolino, M. Animal electricity and the birth of electrophysiology: the legacy of Luigi Galvani. Brain Research Bulletin. 46, 381-407 (1998).
- Albright, T. D., Jessell, T. M., Kandel, E. R., Posner, M. I. Neural Science: A Century of Progress and the Mysteries that Remain. Neuron. 25, (2000).
- Popescu, G. K. Modes of glutamate receptor gating. The Journal of Physiology. 590, 73-91 (2012).
- Morimoto-Tomita, M., et al. Autoinactivation of Neuronal AMPA Receptors via Glutamate-Regulated TARP Interaction. Neuron. 61, 101-112 (2009).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51, 187-200 (2005).
- Huang, Z., Li, G., Pei, W., Sosa, L. A., Niu, L. Enhancing protein expression in single HEK 293 cells. Journal of Neuroscience Methods. 142, 159-166 (2005).
- Raymond, L. A., Moshaver, A., Tingley, W. G., Huganir, R. L. Glutamate receptor ion channel properties predict vulnerability to cytotoxicity in a transfected nonneuronal cell line. Mol Cell Neurosci. 7, 102-115 (1996).
- Suchyna, T. M., Markin, V. S., Sachs, F. Biophysics and Structure of the Patch and the Gigaseal. Biophysical Journal. 97, 738-747 (2009).
- Qin, F. Restoration of single-channel currents using the segmental k-means method based on hidden Markov modeling. Biophys J. 86, 1488-1501 (2004).
- Colquhoun, D., Sigworth, F. J. . chapter in Single-channel recording. 2nd edn eds B. Sakmann and E Neher. , (1995).
- Popescu, G., Auerbach, A. Modal gating of NMDA receptors and the shape of their synaptic response. Nat Neurosci. 6, 476-483 (2003).
- Colquhoun, D., Hawkes, A. G. Stochastic properties of ion channel openings and bursts in a membrane patch that contains two channels: evidence concerning the number of channels present when a record containing only single openings is observed. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 240, 453-477 (1990).
- Kussius, C. L., Kaur, N., Popescu, G. K. Pregnanolone Sulfate Promotes Desensitization of Activated NMDA Receptors. J. Neurosci. 29, 6819-6827 (2009).
- Amico-Ruvio, S., Popescu, G. Stationary gating of GluN1/GluN2B receptors in intact membrane patches. Biophysical Journal. 98, 1160-1169 (2010).
- Borschel, W. F., et al. Gating reaction mechanism of neuronal NMDA receptors. J Neurophysiol. 108, 3105-3115 (2012).
- Colquhoun, D., Hatton, C. J., Hawkes, A. G. The quality of maximum likelihood estimates of ion channel rate constants. The Journal of Physiology. 547, 699-728 (2003).
- Kussius, C. L., Kaur, N., Popescu, G. K. Pregnanolone Sulfate Promotes Desensitization of Activated NMDA Receptors. The Journal of Neuroscience. 29, 6819-6827 (2009).
- Popescu, G., Auerbach, A. Modal gating of NMDA receptors and the shape of their synaptic response. Nat Neurosci. 6, 476-483 (2003).
- Popescu, G., Robert, A., Howe, J. R., Auerbach, A. Reaction mechanism determines NMDA receptor response to repetitive stimulation. Nature. 430, 790-793 (2004).
- Prieto, M. L., Wollmuth, L. P. Gating Modes in AMPA Receptors. The Journal of Neuroscience. 30, 4449-4459 (2010).
- Poon, K., Nowak, L. M., Oswald, R. E. Characterizing Single-Channel Behavior of GluA3 Receptors. Biophysical Journal. 99, 1437-1446 (2010).
- Smith, T. C., Wang, L. -. Y., Howe, J. R. Heterogeneous Conductance Levels of Native AMPA Receptors. The Journal of Neuroscience. 20, 2073-2085 (2000).
- Coste, B., et al. Piezo1 and Piezo2 Are Essential Components of Distinct Mechanically Activated Cation Channels. Science. 330, 55-60 (2010).
- Coste, B., et al. Piezo proteins are pore-forming subunits of mechanically activated channels. Nature. 483, 176-181 (2012).
- Benndorf, K. . chapter in Single-channel recording. 2nd edn eds B. Sakmann and E Neher. , (1995).
