Implantación de la vena cava inferior interposición del injerto en modelo de ratón

Summary

Para mejorar nuestro conocimiento de la formación de neotejido celular y molecular, un modelo murino de la TEVG fue desarrollado recientemente. Los injertos fueron implantados como injertos de interposición de la vena cava infrarrenal en ratones C57BL / 6. Este modelo logra resultados similares a los obtenidos en nuestra investigación clínica, pero durante un transcurso de tiempo mucho más corto.

Abstract

Andamios biodegradables sembrados con células mononucleares de médula ósea (BMC) se utilizan a menudo para la cirugía reconstructiva para tratar las anomalías cardíacas congénitas. Los resultados clínicos a largo plazo mostraron excelentes tasas de permeabilidad, sin embargo, con una incidencia significativa de la estenosis. Para investigar los mecanismos celulares y moleculares de la formación neotejido vascular y prevenir el desarrollo de estenosis en la ingeniería tisular injertos vasculares (TEVGs), hemos desarrollado un modelo de ratón del injerto con aproximadamente 1 mm de diámetro interno. En primer lugar, los TEVGs fueron ensambladas a partir de los andamios tubulares biodegradables fabricadas a partir de un material no tejido de ácido poliglicólico sintieron malla recubierta con copolímero de ε-caprolactona y L-lactida. Los andamios se colocaron entonces en un liofilizador, la aspiradora durante 24 horas, y se almacenaron en un desecador hasta la siembra de células. En segundo lugar, la médula ósea se obtuvieron de ratones donantes y las células mononucleares se aislaron por centrifugación en gradiente de densidad. En tercer lugar, aproximadamente un millón de células fueronsembradas en un andamio y se incubaron O / N. Por último, las células sembradas se implantan a continuación como injertos de interposición de la vena cava infrarrenal en ratones C57BL / 6. Los injertos implantados demostraron excelente permeabilidad (> 90%) sin evidencia de complicaciones tromboembólicas o formación de aneurisma. Este modelo murino nos ayudará en la comprensión y la cuantificación de los mecanismos celulares y moleculares de la formación de neotejido en el TEVG.

Introduction

Las cardiopatías congénitas son enfermedades graves que afectan a casi el 8% de los nacimientos vivos en los Estados Unidos. Aproximadamente el 25% de los recién nacidos con defectos congénitos del corazón o de 2,4 por 1.000 nacidos vivos, requieren tratamiento invasivo en el primer año de su vida ^1. El tratamiento más efectivo para la enfermedad cardiaca congénita es la cirugía reconstructiva. Por desgracia, las complicaciones derivadas de la utilización de conductos vasculares actualmente disponibles son la causa más importante de morbilidad y mortalidad postoperatorias.

Para solucionar este problema, hemos desarrollado los primeros ingeniería tisular injertos vasculares (TEVGs) para uso clínico ^2. TEVGs se construyeron a partir de tubos de poliéster biodegradables sembradas con médula ósea autóloga células mononucleares derivadas (CMN-MO) y implantados como conductos venosos para la cirugía cardíaca congénita. Los resultados mostraron excelentes tasas de permeabilidad a 1-3 años de seguimiento, pero con incidencia significativa de la estenosis <shasta> 3,4. Estaba claro que era necesaria una mejor comprensión de la formación neotejido vascular y el mecanismo subyacente a la aparición de estenosis TEVG. Con el fin de comprender mejor el desarrollo de TEVGs y el mecanismo de desarrollo de la estenosis, un modelo ovino se ha creado ^5,6. En este modelo, los TEVGs transformaron con éxito en los vasos que viven y fueron similares tanto en la morfología y la función de las venas nativas. Este uso de un modelo animal de gran tamaño era un buen primer paso para proporcionar información importante sobre la pre-clínico que ayudó el uso clínico de TEVGs. Sin embargo, la plena comprensión de los mecanismos celulares y moleculares de la formación neotejido vascular en TEVGs utilizando modelos animales grandes es limitada, debido a las limitaciones en la caracterización molecular de fenotipos de células vasculares debido a la falta de especies de herramientas moleculares específicas. Para superar estas deficiencias, un modelo murino de TEVGs fue desarrollado por razón del rápido avance de la genética del ratón y su extensa moleculacaracterización r con la ventaja añadida de una escala de tiempo más corta.

El modelo murino interposición IVC recapitula fielmente el proceso de formación de neovasos que se produce en grandes animales y los seres humanos, pero durante un transcurso de tiempo mucho más corto ^6-9. Aquí, un protocolo detallado para la fabricación del injerto a pequeña escala usando andamios biodegradables, se describe BM MNC-recolección y el aislamiento, la BM MNC-siembra en andamio, y la implantación del injerto en un modelo murino.

Protocol

NOTA: Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Comité del Hospital Institucional Cuidado de Animales y Uso de los Niños de Nationwide. 1. Injerto de fabricación Hacer la solución ε-caprolactona y L-lactida copolímero P (LA / CL) mediante la adición de 100 mg de P (LA / CL) en 2 ml de dioxano bajo una campana de humos. Coloque la solución en un vórtice y se mezcla continuamente durante 1 a 1,5 horas para disolver completamente. Mientras tanto, qu…

Representative Results

Un diagrama esquemático de la implantación TEVG se muestra en la Figura 1. La médula ósea fue cosechada de un ratón donante y mono células nucleares se aislaron mediante centrifugación de densidad y luego sembró en un andamio biodegradable. Las células sembradas se incubaron O / N y se implantaron a un ratón receptor como una vena cava interposición de injerto inferior. La Figura 2 ilustra la microscopía electrónica de barrido del andamio PGA-P …

Discussion

El modelo de ratón de TEVG es una herramienta valiosa para estudiar los mecanismos celulares y moleculares de la formación neotejido y el desarrollo de la estenosis. La cabeza de serie BM-MNC se muestra en ambas imágenes histológicas y de SEM de las células sembradas sobre el injerto ^11. La eficiencia de la siembra de células también se demostró usando un ensayo de ADN ^7. El uso de este sistema modelo se demostró que la siembra de células reduce la incidencia del desarrollo de la estenosi…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
polyglycolic acid (PGA) felt	Biomedical Structures		Custome ordered
ɛ-caprolactone and L- lactide copolymer P(LA/CL)	Gunze Inc.		Custome ordered
Pipet tip, 0.1-10 μl	Fisher Sientific	02-707-456
Lyophilizer	Labconco	7070020
RPMI medium 1604	gibco	11875-093
Petri dish	BD	353003
24 well plate	Corning	3526
15cc tube	BD	352096
Ficoll	Sigma	10831-100ml	Also called 'Histopaque'
DPBS	gibco	14190-144
Littauer Bone Cutter 4.5" Straight	Roboz	RS-8480	For BM harvesting
Forceps 4.5"	Roboz	RS-8120	For BM harvesting
Scissors 4.5"	Roboz	RS-5912	For BM harvesting
Microscope	Leica	M80
C57BL/6J (H-2b), Female	Jackson Laboratories	664	8-12 weeks
Ketamine Hydrochloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Xylazine Sterile Solution	Akorn Inc.	NADA# 139-236
ketoprofen	Fort Dodge Animal Health	NDC 0856-4396-01
Ibuprofen	PrecisionDose	NDC 68094-494-59
Heparin Sodium	Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400
Saline solution (Sterile 0.9% Sodium Chloride)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
0.9% Sodium Chloride Injection	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Petrolatum Ophthalmic Ointment	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Iodine Prep Pads	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Alcohol Prep Pads	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Cotton tipped applicators	Fisher Sientific	23-400-118
Fine Scissor	FST	14028-10
Micro-Adson Forcep	FST	11018-12
Clamp Applying Forcep	FST	00072-14
S&T Vascular Clamp	FST	00396-01
Spring Scissors	FST	15008-08
Colibri Retractors	FST	17000-04
Dumont #5 Forcep	FST	11251-20
Dumont #7 – Fine Forceps	FST	11274-20
Dumont #5/45 Forceps	FST	11251-35
Tish Needle Holder/Forceps	Micrins	MI1540
Black Polyamide Monofilament Suture, 10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	For sutureing the graft
Black Polyamide Monofilament Suture, 6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	For musculature and skin closure
Non-Woven Songes	McKesson Corp.	94442000
Absorbable hemostat	Ethicon	1961
1 ml Syringe	BD	309659
3 ml Syringe	BD	309657
10 ml Syringe	BD	309604
18G 1 1/2 in, Needle	BD	305190
25G 1 in., Needle	BD	305125
30G 1 in., Needle	BD	305106
Warm Water Recircultor	Gaymar	TP-700
Warming Pad	Gaymar	TP-22G
Trimmer	Wahl	9854-500