Summary
Gelişmekte olan embriyoya Drosophila küçük moleküllerin giriş yeni bileşikler, ilaçlar, toksinler ve biyolojik aktivitesini karakterize edici hem de temel geliştirme yolunu tarama için büyük bir potansiyel sunmaktadır. Açıklanan yöntemler burada Drosophila embriyo modelin programını genişleterek, bu yaklaşımın doğal engelleri aşmak adımları özetlemektedir.
Abstract
Drosophila embriyo uzun gelişimini kontrol moleküler ve genetik mekanizmaları ortaya çıkması için güçlü bir laboratuvar model olmuştur. Bu modelle genetik manipülasyon kolaylığı diğer hayvan modelleri ve hücre bazlı deneylerde olağan farmakolojik yaklaşımlar yerini almıştır. Burada gelişmekte olan meyve sineği embriyo küçük moleküllerin uygulama sağlayan bir protokol son gelişmeleri açıklar. Yöntem, embriyo canlılığını korurken kabuğunun geçirimsizliği aşmak için adımlar ayrıntıları. Gelişim aşamaları, geniş bir yelpazesinde Eggshell permeabilizasyon çözücü, daha önce tarif d-limonen embriyo nüfuziyet (1 EPS) uygulanmasıyla ve (18 ° C) daha önce uygulanan tedavilerin indirgenmiş sıcaklıkta yaşlanma embriyoların elde edilir. Buna ek olarak, bir permeabilizasyon göstergesi olarak bir uzak-kırmızı boya (CY5) kullanımı standart kırmızı, yeşil ve gribi kapsayan alt uygulamaları ile uyumlu olan, tarif edilmektedirCanlı ve sabit preparasyonlarda orescent boyalar. Bu protokol, gelişim mekanizmaları sonda olarak karakterize edilmemiş, küçük moleküllerin ya da teratojenik farmakolojik etkinliğini değerlendirmek amacıyla çalışmalar için biyoaktif bileşiklerin kullanılması çalışmaları için de geçerlidir.
Introduction
Drosophila embriyo gelişimi 2 temel mekanizmalarının araştırılması için bir ilk örnek olmaya devam ediyor. Bu güçlü model, herhangi bir zaman noktasında ve herhangi gelişen organ içinde esasen herhangi bir genin manipülasyonlara izin moleküler genetik araçları geniş bir yelpazede tarafından desteklenmektedir. Drosophila embriyonun morfojenezinin küçük boyutlu, hızlı bir gelişme ve kapsamlı karakterizasyonu bu temel gelişimsel geçitler 3,4 ortaya birçoğu genetik ekranlar için seçim bir model olun. Drosophila embriyo çok sayıda fenotipleri özelliği ve kolay yorumlanabilir, genellikle anormal bir özellikten sorumlu yatan moleküler genetik mekanizmaları tanımlamak için bir araç temin edilmiştir.
Tarihsel olarak, uçucu embriyo modelinin bir eksiklik embriyonik dokular için küçük moleküller tanıtan zorlanmasıdır. 1) bize: Bu engel üzerine sınırlamalar poz vardırsondalar gelişimsel mekanizmaları sorgulamak ve 2) uncharacterized küçük moleküllerin teratojenik veya farmakolojik aktivitesini değerlendirmek için Kurulan bu modeli kullanarak olarak bilinen biyoaktif küçük moleküller ing. Bunun bir sonucu olarak, sinek embriyonun tarama olası küçük molekül aktivitesinin karakterizasyonu atıl edilmiştir.
Kabuğu 1) permeabilizasyon ve 2) mikroenjeksiyon: sinek embriyoya küçük moleküllerin teslim iki yöntem ile elde edilebilir. Bu makalede, bir Drosophila geleneksel laboratuar ortamında çalıştırmak kolay nüfuziyet yöntemine avans sunar. Bu teknoloji ile mikro-enjeksiyon ve arayüz yöntemlerinde son gelişmeler, aynı zamanda embriyo 5,6 bileşiklerin tanıtılması için yöntemler ile katkı olduğu not edilmelidir. Embriyoya molekülleri Tanıtımı kabuğu 7 bir yapışkan tabakası ile önlenir. Drosophila yumurta kabuğu beş tabakadan oluşur. Itibareniçten dışa bunlar: vitellin membran, mumsu tabaka, iç koryon tabakası, endochorion ve exochorion 8. Üç dış koryonik tabakalar seyreltik ağartıcı embriyonun kısa daldırma yoluyla kaldırılabilir bir adım Dechorionation olarak anılacaktır. Bu temel vitellin zar ile kaplı kalır maruz yapışkan katman daha sonra, geçirgen hale dechorionated embriyo gibi heptan ve oktan 7,9 gibi organik çözücüler, maruz bırakılarak tehlikeye girebilir. Bununla birlikte, bu çözücülerin kullanımı da toksisite ve embriyo canlılığı 9,10 Stark olumsuz etkileri vardır, her ikisi de güçlü su-geçirimli eylem düzenlenmesinde zorluğu nedeniyle komplikasyonlar getirmektedir.
Çözücü, bir bileşim olarak adlandırılan embriyo geçirgenliği (EPS) kullanılarak nüfuziyet için bir yöntem olup, daha önce tarif edildiği 1 olmuştur. Bu çözücü miscibl olmak için solvent olanak d-limonen ve bitki-türevi yüzey aktif maddeler oluşmaktadırSulu tampon maddeler ile örn. D-limonen ve arzu edilen konsantrasyonlara kadar çözücünün seyreltilmesi için yeteneğinin düşük toksisiteye yüksek canlılığı 1 ile geçirgen embriyolar oluşturmak için etkin bir yöntem vermiştir. Bununla birlikte, iki endojen faktör uygulamaya sınırlamalar getirmek için devam etmiştir. İlk olarak, embriyolar ilgilenmek kapatmak gelişimsel evreleme korumak için alındığında bile, EPS tedaviden sonra geçirgenliği heterojenite göstermektedir. İkincisi, yaklaşık sekiz saatten daha eski yumurta 11 döşeme sonra ortaya kabuğunun bir sertleşme ile tutarlı, geçirgenliği zor kanıtlanmıştır embriyolar.
Burada tarif EPS yönteminde gelişmeler bulunmaktadır: 1) sabitleme parçaları ve immüno-lekeleme adımlar yürütülür ve 2)> (geç gelişim zaman noktalarında, 8 saat, sahne embriyo geçirgenliği sağlayacak sonra bile, yakın aynı permeabilize embriyolar tanımlanması ve analiz yardımcı 12 ve üzeri). Spesifik olarak, bir uzak-kırmızı boya uygulanması,CY5 karboksilik asit, geliştirme sırasında ve formaldehit tespit sonrası embriyo devam geçirgenlik göstergesi olarak hizmet vermektedir tarif edilir. Buna ek olarak, 18 ° C 'de embriyolar yetiştirme geç dönem embriyo (aşamalar 12-16) geçirgenliği sağlayan, bir EPS hassas halde yumurtaların muhafaza gösterilmiştir.
Bu gelişmeler EPS metodoloji için daha önce sözü edilen sınırlamalarının üstesinden gelir. Bu uygulama, bu nedenle canlılığını korurken farklı gelişim zaman noktalarında embriyo ilgilendiren küçük moleküller tanıtmak için bir araç ile araştırmacılar sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Fly Kültürler, Çözümleri ve Embriyo Taşıma Cihazlar hazırlanması
- Drosophila bir kafes kültürü hazırlayın. 10 cm üzüm-agar plakası ve maya macun bir nokta ile donatılmış bir kafes nüfus istenen soyunun 500 + çiftleşme sinekler yerleştirin. 25 ° C nem kontrollü inkübatör kültürünü korumak. Not: Cage kültürler tutarlı embriyo döşeme desenleri elde etmek için klima bir veya iki gün gerektirir. Maya hamur ile üzüm plakaları klima sırasında sabah ve bir kez akşam bir kez değiştirilir.
- EPS hazırlayın. 37 ° C de yüzey aktif maddeler (kokamid DEA ve etoksillenmiş alkol) sıcak çözeltiler Pipet Küçük bir karıştırma çubuğu ile donatılmış bir cam sintilasyon şişesine d-limonen 18 mi. Pipet d-limonen 1 mi, iki yüzey (her biri% 5 nihai konsantrasyon) her biri. İyice karıştırın ve karıştırma çubuğu çıkarın. Not: EPS Bu stok çözeltisi, oda sıcaklığında yaklaşık 2 ay için iyidir. Çözelti37 ° C'de ısıtıldı ve tam kullanımdan önce yüzey aktif çözünür hale getirmek için döndürülmüştür olmalıdır. Zaman içinde bir plastik çözülür gibi EPS ve d-limonen, bir cam kap içinde saklanmalıdır.
- Embriyo dechorionation çözüm, kuluçka ortamları, boya ve ilaç çözümler hazırlayın. 25 ml H2O ve sığ bir kaba yer ağartıcının 25 ml karıştırın. Önceki reçeteye 1,12 göre modifiye temel kuluçka ortamını (MBIM) ve MBIM-T hazırlayın. Shields hazırlayın ve (Malzeme listesi) üreticinin protokolüne göre M3, hücre kültür ortamı ve PBS Sang. DMSO içinde 10 mM konsantrasyonu permeabilizasyon boyasının bir stok çözelti hazırlayın.
- Embriyo işleme cihazları ve malzemeleri birleştirin:
- Dechorionation ve EPS tedavi sepeti (Şekil 1A bakınız) hazırlayın. Ince dişli bir testere ile bir tek 50 ml polipropilen santrifüj / kültür tüpü bir 3 cm bölümü kesin. Yapıştırılır Zımpara üzerinde tüp bölümü sürtünme tarafından kaynak yüzey floş olunbir tezgah üstü yüzeye. Kaynak, bir alev üzerinde tüp bölümün ağız eritilmesi ve bir cam plaka üzerine örgüye basarak Nitex naylon elek tüp bölümü. Serin edelim ve ekstra örgü keserek. NOT: Sırf taraf ve alt ilgili adımlar artık çamaşır suyu ve EPS kapalı hızlı ve tam durulama için izin verir. Kaynak adımlar, davlumbaz altında gerçekleştirilmelidir.
- Bir gelişme sepet hazırlayın. Kapağın kenarı ile aynı hizada bir 50 ml santrifüj / kültür tüpünün üst kısmı kesin. Çıkarın ve Şekil 1B'de gösterildiği gibi, kenar boyunca bir orta açıklık ve çentiklere keserek kapağı değiştirin. Tel üzerinde ve kesilmiş boru bölümünün konuları üzerinde vidalı kapaklı ve ekstra örgü kırpın. Not: kapak 60 mm rezervuar çanak (Şekil 1 B ')' de yer alan zaman bulk ortamına difüzyon izin jant çentikler içermektedir.
- Bir slayt odasının bileşenleri hazırlayın. Daha büyük olan DO membran bir kare kesilmişslayt odası açma. Açıklığın iç dudak vakum gres çok ince bir tabaka uygulanır. Tutma halkası ile yağ karşı sızdırmazlık ağzına DO membran yapıştırın. Yakın tutma halkası için geri keserek aşırı DO membran kesin. NOT:. Slayt odası için Özellikler Kiehart ark 13 bulunabilir Bu bölme ticari olarak mevcut değildir ve bir makine atölyesi ile özel imalat gerektirir.
2.. Sahneleme, dechorionation ve Embriyolar EPS Tedavisi
- Zamanlanmış bir kolleksiyon ile embriyolar evreleme. AM sinek kültür kafesine taze üzüm / maya plakasını ayarlayın. Embriyolar 25 ° C'de 1 saat boyunca döşenecek Veren Bu plaka atın ve 25 ° C'de 2 saat daha sonraki bir embriyo döşenmesi için yeni bir üzüm / maya plakası ile değiştirin Daha gelişimsel evreleme için 18 ° C inkübatör bu plaka ve yeri toplayın. NOT: 25 ° C'de 1 saat geliştirme gelişim 2 saat eşittir18 ° C'de Geç dönem embriyo, EPS geçirgenliği muhafaza 25 ° C karşısında 18 ° C 'de yaşlanma etkisi Şekil 2'de görülebilir.
- Dechorionation. Yavaşça 25 ° C musluk suyu ve bir fırça kullanarak örgü sepet içine üzüm plaka kapalı embriyolar durulayın. Musluk suyu yumuşak bir akışı altında sepete embriyolardan aşırı maya durulayın. 2 dakika boyunca% 50 çamaşır suyu ile sepet bırakın. Iyice musluk suyu akışı altında embriyolar yıkayın. NOT: hafifçe aralıklı plastik bir pipet kullanarak embriyolar üzerinde çamaşır suyu fışkırtma. 2 dakika tam Dechorionation için genellikle yeterli iken, kuluçkalama süresi, doğrudan incelenmesi ile kontrol edilir ve buna uygun olarak ayarlanmalıdır. Musluk suyu içine daldırılmış sepete dechorionated embriyoların bakımı ve EPS aşamasından hemen devam edin.
- EPS Tedavi
- Her PBS yaklaşık 10 ml ile 60 mm altı yemekler hazırlayın. 2.925 ml MTE 75 ul EPS eritilerek EPS seyreltme hazırlayınDöndürme ile bir 50 ml'lik bir cam çanak içinde M (1:40). Not: Bu karışımdan beyaz bir emülsiyon biçimleri.
- Silin bir laboratuvar ile örgü sepetin altından aşırı su kurutun. Beher içinde seyreltilmiş EPS sepet daldırın ve hemen sepetin alt EPS çözelti içinde embriyo dağıtmak için girdap. 30 saniye boyunca hareket dönen devam ediyor. Not: EPS seyreltmeler ve maruz bırakma süreleri geçirgenliği kontrol etmek için değiştirilebilir. Bu, en uygun EPS seyreltmeler ve tedavi süresi kullanılan sinekler suşları ile empirik olarak tayin edilmesi önerilir. 60-90 sn pozlama süresini artırmak aşamada 12 ve üzeri embriyolar için uygundur.
- , Sepet kaldırmak silin bir laboratuvar ile aşırı EPS uzakta kurulayın. 60 mm tabaklar PBS, 10 ml altı ardışık yıkama devam edin. Yavaşça, altı yıkama her PBS ile embriyolar fışkırtma için plastik bir pipet kullanın. Boya geçin ve ilaç tedavisi adımlar. Not: EPS lavabo aşağı bertaraf edilebilir.
Permeabilize Embriyolar 3.. Boya ve İlaç Tedavisi
- Boya Tedavi
- 10 mM CY5 karboksilik asit boya *, bir 1.5 ml mikrofüj tüpe ve karıştırmak için girdap MBIM-T (50 uM son konsantrasyon) ve 1 ml 5 ul ekle. NOT: * boya seçimi alt analizi bağlıdır. CY 5 karboksilik asit tespit ve immüno-lekeleme kullanılarak daha sonraki analizler için etkilidir. Rhodamine B canlı embriyo analizi için yararlıdır. Rodamin B kırmızı emisyon ve onun metabolitleri 1 yeşil emisyon, floresan kullanan alt uygulamalar ile bazı komplikasyonlar ortaya çıkabilir. Ilaç veya toksini içerir, bu aşamada tedavi başlatmak için ya da bu aşamada bir pals için ilaç / toksin tedavisi sınırlamak için boya çözeltisine ilave edilebilir. Bakım MSDS ve çevre güvenlik standartlarına uygun olarak işlemek ve uyuşturucu ve toksinlerin atılması için alınmalıdır.
- Bir fırça ile boya çözeltisine örgü sepet embriyolar aktarın. Tüpü Cap ve sağlamak için tekrar tekrar tersembriyolar boya çözeltisi içinde süspansiyon içinde serbestçe yüzer. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir sallanan rocker tüpü yerleştirin.
- Nutator dan tüpünü çıkarın ve embriyolar razı olsun. Ince bir pipet ile boya çözeltisini çıkarın ve yıkama MBIM-T'nin, 1 ml ile değiştirin. Tamamen embriyolar yeniden askıya tüp ters. Embriyolar razı olsun ve daha üç MBIM-T yıkar tekrarlayın. Son durulama tüm MBIM-T çıkarın ve inkübasyon adıma geçin.
- Embriyo Gelişimi için inkübasyon
- Gelişme sepet veya slayt odası: iki odadan birine embriyolar transfer. Not: gelişimi sepet uzun süreler boyunca gelişim tercih edilir, ve daha sonra sabitleme ve immüno-lekeleme adımları yürütülecek ise gereklidir. Slayt odası yüksek çözünürlük time-lapse görüntüleme için en uygun ve kısa gelişim dönemleri (örneğin, erken embriyonik olaylar) için etkilidir. Ilaç veya toksini çeşitli konsantrasyonları ve embriyo d ortama eklenebilirevelopment standart fiksasyon kullanarak ve protokolleri immünolekeleme canlı embriyolar veya bir ucundaki gerçek zamanlı olarak izlenebilir.
- Sepetleri Kalkınma
- % 70 etanol ile oyuncak bir gelişme sepet temizleyin, de-iyonize su ile iyice yıkayın ve silin laboratuvar ile kuru kurulayın. Ilaç veya toksini istenen konsantrasyonuna sahip inkübasyon ortamının 6 ml hazırlayın. Kafes tabanının altında 60 mm çanak alarak bakım için değil tuzak hava kabarcıkları ortam içinde gelişme sepetini yerleştirin. Not: Two ortam yaygın olarak kullanılır: 50:50 karışımı içinde tek başına MBIM veya MBIM/M3, ikinci daha uzun gelişme dönemlerinde daha etkili olması.
- Bir fırça ile sepet bazında yüzey mesh geçirgenleştirilmiştir embriyolar transfer. Yavaşça çevreleyen rezervuar medya ile embriyolar fışkırtma. Bu ağ üzerinde bir tek tabaka içinde böylece fırça ile embriyolar dağıtılır. Not: Mikroskopi görüntüleme geçin ve pr Permeabilization ve canlılık özelliklerini değerlendirmekAyırma (adım 4).
- Slayt Odası Kalkınma
- Slayt odası ters çevirin ve açıklığın çevre üzerinde vakum yağ küçük bir boncuk uygulanır. Açıklık ÇO zarın yüzeyi üzerinde ilaç ya da toksin istenen miktarda ortam 150 ul koyun. Not: Two ortam yaygın olarak kullanılır: 50:50 karışımı içinde tek başına MBIM veya MBIM/M3, ikinci daha uzun gelişme dönemlerinde daha etkili olması.
- Bir fırça ile medya damlasına geçirgenleştirilmiştir embriyolar transfer. Onları damla içinde zar üzerinde yerleşmek yapma embriyolar dağıt.
- Dikkatlice böylece orta düzleştirme ağzına 25 mm dairesel bir lamel uygulanır. Yağ ile bir conta oluşturmak üzere lamel çevresi boyunca yavaşça bastırın. Not: (Adım 4) hazırlanması Permeabilization ve canlılık özelliklerini değerlendirmek için görüntüleme mikroskop geçin.
4. Identipermeabilize Canlı Embriyolar bahsedilmekte
- Permeabilize embriyolar tespit. Bir dijital kamera ile donatılmış bir mikroskop ile epifluoresan altında embriyolar gözlemleyin. Sabit mikroskop ve kamera ayarlarını kullanarak çeşitli alanları (profil sarısı otoflüoresanı belirlemek için mavi dalga boyunda) görüntü kazanır.
- Nispi floresan yoğunluğuna göre embriyo geçirgenliği belirler. Sepeti karşılamak için ve embriyoların manipülasyon sağlamak için büyük bir çalışma mesafesi olan bir stereo mikroskop kullanarak. Mikroskop programlanabilir XYZ aşamada, epifluorışıma aydınlatma ve bir dijital kamera ile donatılmış olmalıdır. Görüntü daha sonraki bir zaman noktasında aynı embriyoların yeniden değerlendirilmesine olanak maruz ve her embriyo görüntünün sahne pozisyon parametreleri kaydetmek için özen embriyolar (Şekil 3 temsili bir sonuç bakınız). Not: Boya alımı şekilleri, kullanılan boyanın, maruz kalma ve embriyo yaşı uzunluğuna bağlı olarak değişir. Geniş bir yelpazedetek bir preparat içinde boya alımı üzerinde tipik ve nüfuziyet derecesindeki varyasyonu göstermektedir.
- , Embriyo tanımlayın. Permeabilize embriyo konumunu işaretlendikten sonra, oda sıcaklığında ya da 25 ° C 'de devam embriyo gelişimi Mikroskop için sepet veya slayt odasına dönün. Kanal mavi floresan altında gözlemlemek ve önceden belirlenen geçirgenleştirilmiştir embriyoların sarısı otofloresanm görüntü kazanır. Yumurta sarısı dağılım normal ilerleme göre uygunluğunun değerlendirilmesi (Rand ve diğerleri. 1 ve Şekil 3 'de temsili bir sonuç bakınız). Not: Aydınlık mikroskopi ile gözlenir embriyo diğer morfolojik özellikleri uygulanabilirliğini değerlendirmek için de kullanılabilir. Bu canlılığı ile uyumlu geçirgenlik düzeyini kuran her bir boya ve ikinci sineği suşu ile deneysel olarak tespit edilmesi önerilir.
- Permeabilize canlı embriyoların ilaç veya toksin etkilerini değerlendirir.
- Prosedürü EmbriyolarYukarıdaki protokol geleneksel bir dizi için hazır edilir ile bastırılacaktır ilaç veya toksini maruz kalma sonucu daha sonra analiz eder. Analizlerin çeşitli türlerde birçok aşağıda Tartışma kabul edilir ve doğrudan canlı embriyoların morfolojilerinden gözlem yanı sıra post-tespit İmmünoboyama analizleri içerir. Bu yaklaşımların her ikisi de gen ekspresyonu ve hücre soy ve morfolojisi profillerini ortaya vital boyaların (örn., GFP) kullanılarak geliştirilmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Embriyo taşıma cihazları yukarıdaki Protokoller'de manipülasyon için "ev yapımı" cihazları görselleştirme yardımcı olmak için Şekil 1'de resmedilmiştir. Şekil 2'de görülen sonuçlar gelişiminin geç safhalarında EPS ile geçirgen olması kabiliyetleri üzerinde 18 ° C 'de embriyolar yetiştirme güçlü etkisini gösterir. Bu durum protokol aşama 2.1 'de uygulanır. Tipik olarak muamele edilmiş EPS embriyolar görülen geçirgenlik çeşitli düzeylerde ortaya çıkarmak için CY5 karboksilik asit boyanın etkinliği Şekil 3 'de görülmektedir. Sarısı boya dağılımının gelişim dinamikleri de uygulanabilirliğini değerlendirmek için bir kriter ortaya, Şekil 3' de görülmektedir Protokol açıklandığı gibi 4.2 adım. Toksin tedavisi, formaldehit tespit ve imüno sonraki embriyo geçirgenliği belirlenmesinde CY5 boyanın programı Şekil 4'te sonuç ile görüntülenmiştir.
EPS yöntemi için Şekil 1. Embriyo taşıma cihazları. Düz dipli sepet dechorination kullanılan ve pozlama adımları (A, A ') EPS edilir. Gelişme sepet permeabilize embriyonun gelişim uzun maruz kalma (B, B ') için kullanılır. Slayt odası kısa gelişimsel pozlama ve canlı embriyoların yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kullanılır (C, C '. Daha fazla açıklama için metne bakınız).
Şekil 2,. Etkisi geç evre embriyolarda EPS etkinliği üzerinde 18 ° C 'de yaşlanma. Embriyolar, 20 saat (Panel AA "için 18 ° C' de yaşlanma, ardından iki saat boyunca toplandı
Şekil 3,. Geçirgen ve canlı embriyolar Cy5 kullanılması. Embriyolar (25 ° C, aşama 12 de 7-9 saat embriyo eşdeğer) 18 ° C 'de 14 saat boyunca 2 saat ve yaşları 25 ° C'de toplandı. Dechorination sonra, tedavi CY5 boya inkübasyondan (15 dakika boyunca MBIM-T içinde 50 uM) ve ardından (1 dakika boyunca MBIM olarak 1:40) yapıldı EPS. Embriyolar MBIM-T içinde üç kez yıkanmış ve rezervuar içinde MBIM ile gelişme sepete transfer edilmiştir. Development p bırakıldıOda sıcaklığında 8 saat için roceed. Cy5 (Kırmızı) alımından hemen boya tedavisi ve yıkama (Panel A) ve sonra 8 saat geliştirme (Panel B) 'den sonra uzak-kırmızı kanalında görüntülenmiştir edilir. Sarısının dağıtım mavi kanalda otofloresansı tarafından görülür. Boya alımı, bu nedenle geçirgenlik, embriyo embriyoya farklılık görülmektedir. CY 5 boya (kırmızı) aşama 16 (mor, Panel B) de bağırsak lümenine konsantre hale sarısı (mavi), lokalize edilmesi için görülmektedir.
Sabit ve immunohistokimyasal embriyolarda permeabilizasyon ve PTWI etkileri Şekil 4.. Belirlenmesi. Embriyolar (25 ° C, aşama 12 de 7-9 saat embriyo eşdeğer) 18 ° C 'de 14 saat boyunca 2 saat ve yaşları 25 ° C'de toplandı. Dechorination sonra EPS tedavi inkübasyon, ardından (1 dakika boyunca MBIM olarak 1:40) yapıldıCY 5 boya (15 dakika boyunca MBIM-T içinde 50 uM) birlikte PTWI ile (50 uM MeHg, Panel B) ya da DMSO kontrol çözücü (% 0.1 'lik nihai konsantrasyon, Panel A). Embriyolar MBIM-T ile yıkandı ve MBIM ile bir geliştirme sepet içine yerleştirildi: M3 rezervuar ortamı ve oda sıcaklığında ilave bir 8 saat daha bekletilmiştir. Embriyolar daha sonra standart bir protokol 14 ile iki fazlı bir% 4 paraformaldehid-heptan hazırlanmasında sabitlendi. Boyama motor nöronları ve anti-ELAV antikorları (A kırmızı, B) her nöron hücre gövdeleri etiketlemek için etiket bir anti-fasciclin II (A, B, yeşil ve beyaz A ', B') ile gerçekleştirildi. CY5 boya (CY5 sözde renkli tüm panellerde mavi) nedeniyle tespit nedeniyle azalmış floresan yoğunluğu uzun pozlama gerektiren doğrudan floresan, ortaya çıkar. MeHg etkileri düzensiz modelleme ve kümelenme görülür(kırmızı etiketli ve A'ya karşı B beyaz oklarla gösterilir ELAV-pozitif) yanal chordotonal nöron hücre gövdeleri halkası. Buna ek olarak, segmental (SN) (A yeşil katı oklar ') karakteristik bir dallanma embriyo 15 MeHg daha önce rapor edilmiş etkileri ile tutarlıdır MeHg maruz kalma (B bir katı yeşil oklar ") ile son derece değişken olduğu görülmektedir. Intersegmental ve köklerindeki sinirleri segmental Projeksiyon MeHg maruz (B açık yeşil ok ') ile arkaya deplase olduğu görülmektedir. Not: PTWI güçlü bir nörotoksin. Bakım tutarken eldiven ve koruyucu gözlük alınmalıdır. Bertaraf kurumsal çevre güvenliği tesis ve hizmet yoluyla yapılmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıdaki yöntem, geniş bir gelişim aralığında küçük molekül tedavileri için erişilebilir uygun bir Drosophila embriyoların elde edilmesi için bir yöntem açıklar. Bu yöntem daha önce sadece erken evre embriyolar görüldüğü gibi 18 ° C'de embriyolar yaşlanma aynı etkinlikte geç evre embriyoların geçirgenliği sağlayan yeni ve basit bulma tanıttı. Buna ek olarak, geçirgenlik göstergesi olarak uzak-kırmızı boya CY5 karboksilik asidin kullanımı sonrası düzeltme uygulamalarında etkili olduğu kanıtlanmıştır ve gelişim fenotipleri ortaya çıkarmak için kullanılabilir geleneksel kırmızı ve yeşil floresan işaretleri ile karışmaz. Bu bulgular, önemli ölçüde EPS metodun etkinliğini ve programı önceden.
Bu yöntem, yaşam ve sabit embriyo hazırlıkları hem analizlere müsait. Aydınlık mikroskopi ve kurmak slayt odası kullanılarak, embriyo gelişiminin ilk yarısında puan tipik özellikleri morfogenetik hareketler gibiblastodermin, sefalik karık oluşumu germband uzama ve geri çekme germband 1 cellularization. GFP veya RFP gazetecilere daha spesifik son noktalar, örneğin, erken segmentasyon modelleri ve sonraki gelişimi 1 nöral yapıların oluşumunu ayırt edilebilir. GFP ve RFP raporlar da slayt odası ve gelişimsel sepet hazırlıkları hem geçirgenleştirildi embriyolar yaşayan gelişimsel olayların gözlem sağlar. Uygulanan bir ilaç veya kimyasal brüt toksisitesini belirlemek için basit bir yöntem geliştirme 1 bir gecikme ya da durdurulması belirlemek için mavi kanalda sarısı protein otomatik floresans desen izlemektir.
EPS metodoloji ayrıca sigara modeli böcekler, kabuğunun benzer bir mimari paylaşan, özellikle sivrisinek, için soruşturma araçları genişletilmesi için büyük bir potansiyele sahiptir. Diğer böcek türlerinin embriyolar küçük moleküllerin uygulama investigati bir yol açmak istiyorumnerede işlevsel çalışmalarda standart genetik yaklaşımlar şu anda eksiktir. Sepet geliştirilen embriyolar bu nedenle Drosophila çalışmaları için immüno-lekeleme reaktiflerin geniş bir dizi analizleri açılması, formaldehit tespit için işlenebilir. Ancak bu adım geçirgenleştirmeden bir post-fix belirleme ilaca erişimine olmuştu embriyolar ile fenotipleri ilişkilendirilmesi mümkün olmasını gerektirir. CY 5 karboksilik asit boyanın uygulama bu yaklaşım için oldukça etkili olduğu kanıtlanmıştır. CY 5 karboksilik asit etkili bir şekilde geçirgen embriyolar (Şekil 3A) içerisine alınır. Gelişimi sırasında CY5 sonunda (Şekil 3B) daha sonraki bir aşamada 14 de oluşturucu bağırsak lümeni içinde tecrit edilmiş ve yumurta sarısı, konsantre hale getirilmektedir. Tespit edildikten sonra, CY5 floresan belirgin olarak azalmıştır, ancak güvenilir bir tespit bağırsakta ve (bkz. Örnek res etkin en başta geçirgenleştirir hale getirildi ve bu embriyo, bir belirteci olarak hizmet eder;Ult Şekil 4). Bu aşamada CY5 algılama tespiti için daha uzun maruz kamera (örneğin 1-4 saniye) gerektirir unutulmamalıdır. Bu nedenle, immüno-desenli fenotipleri skor doku spesifik belirteçleri (örneğin, Şekil 4'te görülen sinir özel antikorlar) ile birlikte aynı şekilde geçirgen embriyolar onaylamak için CY5 sinyali kullanılarak devam edebilir.
Bu yöntemde en büyük sorun Permeabilization süreci, uzun zamandır bu yöntemi 9,10,16 geliştirmek için önce girişimleri sorunlu olan şey embriyo canlılığı hassasiyetidir. Geçirgenleştirmeden sonraki Canlılık yaşa bağımlı yalın ve önemli ölçüde artırır eski embriyo geçirgenleştirmeden 9 bağlıdır. Daha önce gösterildiği gibi henüz, geçirgenlik 1 yaş ile giderek daha zor hale gelir. Yeni bir rapor şimdi yeniden çağırarak hep ile geç evre embriyolar (evre 14) geçirgenliği yeteneğini gösterird-limonen 17 ile bağlantılı olarak, bir çözücü olarak tane. Sadece bir ilaç etkisi karakterize edilmiştir (nokodazol) ve önceki aşamada embriyolar uygulamaya 17 açıklanmayan gibi, bu ikinci yöntemin geniş bir kullanım alanına açık değildir. Ayrıca, daha fazla verimler geç evre geçirgenliği, yukarıda belirtilen 18 ° C geliştirme aşamasının uygulanması ve toksik organik çözücülerin kullanımından kaçınır. EPS protokolüne yeni Araştırmacı ilk girişimleri üzerine permeabilizasyon ve canlılığı sonuçları değişkenlik yaşayacaksınız. Burada özetlenen adımlar sistematik kendi laboratuar ortamında çalışan Drosophila belirli suşları için koşulları optimize etmek permeabilizasyon tedavi ve sonraki İnkübasyon koşulları değiştirmek için Araştırmacı araçları sağlar.
Yöntem ile yapılan ek bir embriyodan embriyoya görülen kimyasal alımındaki değişkenlik. Bu değişkenlik ve heterojen yansıtılırCY 5 boya alımı hemen boya tedavisi (Şekil 3A) sonra embriyolar görülür. Buna karşılık, boya Rhodamine B daha hızlı ve eşit olarak embriyonik dokular arasında dağılmış CY5 boya (Şekil 2B ") daha hızlıdır. Bu nedenle, bazı embriyo-to-embriyo değişkenlik kimyasal, uyuşturucu ya da ilgi toksin dağıtım özellikleri barındıran ve yönteme doğasında olabilir. Dozun miktar kritik olduğu durumda, bu, ilgi konusu ilaç veya toksini alımı alternatif bir analitik metod ile karakterize önerilir. Bununla birlikte, yukarıdaki protokol kolaylığı ve embriyo yüzlerce ekrana yeteneği son derece gelişmiş bu karakterize ilaçlar veya toksinler güçlü bir ilk yaklaşım için yapım, doz yanıtları değerlendirmek ve kaynaklarının küçük bir yatırım ile karakteristik fenotipleri puan araştırmacı sağlar model sistem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fly Cage | Flystuff.com | 59-101 | http://flystuff.com/general.php |
| Cocamide DEA [Ninol 11-CM] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| Ethoxylated alcohol [Bio-soft 1-7] | Stepan Chemical | call for special order | http://www.stepan.com/ |
| d-limonene (Ultra high purity grade) | Florida Chemical Co. | call for special order | http://www.floridachemical.com/ |
| Sodium hypochlorite | Fisher | SS290-4 | http://www.fishersci.com/ |
| Tween-20 | Fisher | BP337 | http://www.fishersci.com/ |
| PBS powder | Sigma | 56064C | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Rhodamine B | Sigma | R6626 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| CY5 carboxylic acid | Lumiprobe | #23090 | http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid |
| DMSO | Sigma | 472310-100 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Shields and Sang M3 medium | Sigma | S8398 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Nitex Nylon mesh | Flystuff.com | 57-102 | http://flystuff.com/misc.php |
| Dissolved oxygen (DO) membrane | YSI | #5793 | http://www.ysireagents.com/search.php |
| 25 mm circular no.1 cover slip | VWR | 48380-080 | https://us.vwr.com/ |
| Grape-agar plate mix | Flystuff.com | 47-102 | http://flystuff.com/media.php |
| Nutator | VWR | 82007-202 | https://us.vwr.com/ |
References
- Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules. Insect biochemistry and molecular biology. 40, 792-804 (2010).
- Jaeger, J., Manu,, Reinitz, J.
- Kopczynski, C. C., et al. A high throughput screen to identify secreted and transmembrane proteins involved in Drosophila embryogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 9973-9978 (1998).
- Bejsovec, A., Chao, A. T. crinkled reveals a new role for Wingless signaling in Drosophila denticle formation. Development. 139, 690-698 (2012).
- Zappe, S., Fish, M., Scott, M. P., Solgaard, O. Automated MEMS-based Drosophila embryo injection system for high-throughput RNAi screens. Lab on a chip. 6, 1012-1019 (2006).
- Delubac, D., et al. Microfluidic system with integrated microinjector for automated Drosophila embryo injection. Lab on a chip. 12, 4911-4919 (2012).
- Mahowald, A. P. Fixation problems for electron microscopy of Drosophila embryos. Drosophila Info Serv. 36, 130-131 (1962).
- Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell. Journal of cell science. 43, 1-35 (1980).
- Mazur, P., Cole, K. W., Mahowald, A. P. Critical factors affecting the permeabilization of Drosophila embryos by alkanes. Cryobiology. 29, 210-239 (1992).
- Arking, R., Parente, A. Effects of RNA inhibitors on the development of Drosophila embryos permeabilized by a new technique. The Journal of experimental zoology. 212, 183-194 (1980).
- Li, J. S., Li, J. Major chorion proteins and their crosslinking during chorion hardening in Aedes aegypti mosquitoes. Insect biochemistry and molecular biology. 36, 954-964 (2006).
- Strecker, T. R., McGhee, S., Shih, S., Ham, D. Permeabilization staining and culture of living Drosophila embryos. Biotech Histochem. 69, 25-30 (1994).
- Kiehart, D. P., Montague, R. A., Rickoll, W. L., Foard, D., Thomas, G. H. High-resolution microscopic methods for the analysis of cellular movements in Drosophila embryos. Methods in Cell Biology. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. 44, Academic Press. San Diego. 518 (1994).
- Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical uses in cell and molecular biology. Methods in Cell Biology. 44, Academic Press. 445-487 (1994).
- Engel, G. L., Delwig, A., Rand, M. D. The effects of methylmercury on Notch signaling during embryonic neural development in Drosophila melanogaster. Toxicol In Vitro. 26, 485-492 (2012).
- Limbourg, B., Zalokar, M.
- Schulman, V. K., Folker, E. S., Baylies, M. K. A method for reversible drug delivery to internal tissues of Drosophila embryos. Fly (Austin). 7, (2013).
