Análise abrangente de Transcrição Dynamics de amostras de cérebro seguinte experiência Behavioral
Summary
This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.
Abstract
A codificação de experiências no cérebro e na consolidação de memórias de longo prazo dependerá de transcrição do gene. Identificar a função de genes específicos em experiência de codificação é um dos principais objetivos da neurociência molecular. Além disso, a associação funcional de genes definidos com comportamentos específicos tem implicações para a compreensão da base de transtornos neuropsiquiátricos. A indução da transcrição de programas robustos foi observado no cérebro de ratinhos após várias manipulações comportamentais. Enquanto alguns elementos genéticos são utilizados recorrentemente seguinte diferentes manipulações comportamentais e em diferentes núcleos do cérebro, os programas de transcrição são em geral única para os estímulos indutores e a estrutura na qual eles são estudados 1,2.
Nesta publicação, um protocolo é descrito para perfilamento transcricional robusta e abrangente de núcleos cerebrais de ratos em resposta à manipulação comportamental. Aprotocolo é demonstrado no contexto da análise da dinâmica de expressão de genes no núcleo accumbens seguinte experiência aguda cocaína. Subseqüente a um definido na experiência vivo, o tecido neural alvo é dissecado; seguido por purificação de RNA, a transcrição reversa e a utilização de matrizes de microfluidos para a análise detalhada de qPCR de múltiplos genes alvo. Este protocolo é voltada para análise abrangente (dirigindo-50-500 genes) de limitar a quantidade de matéria-prima, tais como amostras de cérebros pequenos, ou mesmo uma única célula.
O protocolo é o mais vantajoso para a análise de amostras múltiplas em paralelo (por exemplo, células isoladas, análise dinâmica seguinte farmacêutica, viral ou perturbações comportamentais). No entanto, o protocolo também pode servir para a caracterização e garantia de qualidade das amostras antes de estudos todo o genoma por microarrays ou RNAseq, bem como a validação dos dados obtidos a partir de estudos de todo o genoma.
Introduction
Organização dinâmica do cérebro permite flexibilidade cognitiva e comportamental. Experiências são codificadas através de modificações da estrutura e força das conexões entre os neurônios no cérebro 3. Este "dependente da experiência plasticidade" é o resultado da indução de padrões específicos da expressão do gene que fornece as proteínas necessárias para a modificação da estrutura e força 4 sináptica. A identificação de redes de regulação gênicas mediar a formação de memórias de longo prazo é um princípio central da neurociência molecular, com a expectativa de que a identificação dos elementos dominantes de programas de transcrição irá fornecer uma visão sobre os princípios fundamentais que regulam a formação da memória, bem como metas para tratamento de doenças neurodegenerativas e distúrbios neuropsiquiátricos. Programas de transcrição desdobrar-se em ondas temporalmente definidos, cada um dos quais codificam genes de caráter diferente, que são importantes para destágios iferentes na implementação dos resultados do evento de sinalização 1,2. Por isso, é importante abordar a dinâmica de transcrição em um prazo temporal, detalhado, de modo a identificar o conjunto completo de genes induzidos, e obter insights sobre sua função potencial de acordo com a dinâmica de sua indução.
A dependência de drogas é uma forma robusta de dependentes de experiência plasticidade causada pelos efeitos duradouros das drogas de abuso em circuitos neurais no cérebro 5,6. Inicial, a exposição aguda a drogas pode levar ao desenvolvimento de dependência e da transição para a utilização crónica. A informação contextual é um elemento crucial para o desenvolvimento de dependência. Pistas ambientais associadas à droga são atribuídas importância significativa nas mentes dos usuários de drogas. A informação contextual lembrando um usuário de drogas de experiência de drogas no passado pode induzir a recaída ânsia de drogas, mesmo após longos períodos de abstinência de exposição ao fármaco 7,8.Daí o grande desafio clínico em vício – a propensão dos adictos recaírem mesmo muito tempo depois de os sintomas de abstinência têm abrandado 9.
Sensibilização comportamental à cocaína é um modelo simples de cocaína experiência útil no estudo dos mecanismos da dependência de drogas. Neste modelo amplamente estudado para a sensibilização de longa duração induzida pela exposição crônica às drogas de abuso, roedores estão habituados a primeira injeção de solução salina (intraperitoneal, IP) em um ambiente de romance (uma câmara de campo aberto, no qual sua atividade locomotora é monitorado) ; em seguida, eles recebem injecções diárias de cocaína nas câmaras de campo abertas, enquanto a sua actividade é monitorizada 10 (Figura 1). Este paradigma comportamental resulta tipicamente numa sensibilização robusta de comportamento locomotor (8-12 vezes superior actividade de linha de base) 11, que é mantida durante um período de vários meses após a cessação das injecções de cocaína, demonstrando a formação de um taradotraço de memória ASIVE de experiência com drogas.
O circuito neural de recompensa, naturalmente envolvido em reforçar comportamentos essenciais para o sucesso de uma espécie (por exemplo, alimentação, sexo), é explorada por drogas de abuso para reforçar comportamentos associados ao fármaco 12,13. Os mecanismos moleculares e celulares, através da qual a experiência de drogas de abuso é aumentada parecem ser semelhantes aos mecanismos subjacentes à formação da memória declarativa ou semânticas em outras estruturas cerebrais 14. Portanto, a robustez do modelo sensibilização comportamental faz com que seja um sistema modelo atraente para estudar mecanismos de dependentes de experiência plasticidade.
O núcleo accumbens (NAC) é um integrador central do circuito de recompensa do cérebro, e tem sido extensivamente associados com o desenvolvimento da dependência de 5,6. A formação de vício depende da transcrição de novas proteínas no núcleo accumbens, e robusto emprodução de programas de transcrição bem estruturados é observado no NAc seguinte experiência cocaína 15-19. A resposta transcricional aguda a exposição à cocaína é susceptível de funcionar em vários níveis, a fim de adaptar-se ao forte estímulo de indução e para direcionar a produção de novas proteínas que são responsáveis pelas mudanças estruturais e eletrofisiológicas induzidas pela exposição à droga 6,19-22.
A fim de promover o estudo dos mecanismos moleculares dos dependentes de experiência plasticidade no cérebro, um protocolo descrito para a análise global da dinâmica de transcrição em amostras de tecido cerebral após a manipulação comportamental. O protocolo é ilustrada no contexto da experiência comportamental estudada no laboratório Citri – sensibilização comportamental à cocaína, utilizando matrizes dinâmicas de microfluidos para a análise da transcrição. O protocolo descrito, obviamente, não se limita ao estudo tele nucleus accumbens no contexto da sensibilização comportamental, mas poderia ser aplicado a um grande número de paradigmas comportamentais e regiões do cérebro. Na verdade, este protocolo pode ser aplicado aos tecidos do corpo fora do cérebro, e uma variedade de experiências ou manipulações do organismo estudado.
O protocolo é dividido em quatro etapas. No primeiro passo, o animal é submetido ao paradigma comportamental; No segundo passo, o tecido é microdissecados; na terceira etapa – mRNA é purificado, reversamente transcrito e sondadas, e na etapa final, os dados são analisados.
No contexto do estudo da dinâmica de transcrição, o tempo preciso e definição da experiência são provavelmente os parâmetros experimentais mais importantes para o controle. Por esse motivo, o nosso modelo de comportamento de escolha é a de sensibilização comportamental à cocaína, um sistema que permite elevado nível de controlo sobre os parâmetros do experimentador da experience. Paradigmas comportamentais adicionais que permitem o sincronismo preciso e abordam diferentes modelos de dependentes de experiência plasticidade ou a formação da memória estão disponíveis. Estes modelos incluem o medo condicionado 23, enriquecimento ambiental aguda 24,25, romance objeto de exploração 26 e experiência visual após criação escuro 27. Ainda assim, a sensibilização comportamental à cocaína é uma manipulação comportamental consistentemente robusta, criando um traço de memória altamente penetrante, que dura meses seguintes experiência cocaína 28.
O cérebro é seccionado, seguido por microdissecção manual dos nucleus accumbens. Tem sido a nossa experiência que microdissecção Manual de fatias de cérebro rapidamente preparados proporciona o método mais fiável e rápido de extracção do tecido relevante para o paradigma comportamental, e com a experiência, as fronteiras do tecido tornam-se evidentes e facilmente reconhecidas. Alternativamente, fatias finas poderiam ser prepared, seguido por captura a laser microdissecção. Embora este método permite a delineação muito da região de interesse definidas, isto é lento (correndo assim o risco de perda de ARNm lábil), fastidioso e requer equipamento dispendioso dedicado (um microscópio equipado com uma instalação de captura por laser). O protocolo aqui definido também pode ser adaptado para análises de transcrição de uma única célula, por aspiração do citoplasma das células identificadas visualmente, utilizando pipetas de remendo 29. É importante notar que o protocolo descrito fornece uma média populacional, ao mesmo tempo que é altamente provável que, na maioria dos casos, apenas uma sub-população de células dentro do tecido são, na verdade, envolvido na resposta à experiência. É de interesse para o perfil de transcrição de forma seletiva a partir de dentro de populações de células específicas em resposta à experiência, mas a discussão dessas abordagens está além do escopo atual.
Para a purificação de ARNm, transcrição reversa e de qPCR de consulta, o tecidoé interrompido por passagem através de agulhas finas, seguido pela utilização de kits comerciais (para mais informações, consulte a Tabela 8). A escolha é informado pela experiência com essas metodologias que garantam a extração segura de RNA de alta qualidade e resultados robustos de aplicações a jusante.
Enquanto o protocolo é descrito por de alto rendimento qPCR utilizando matrizes dinâmicas, as amostras podem ser sondado para a expressão de genes usando ponto final PCR, de baixo rendimento qPCR, microarrays de expressão gênica ou seqüenciamento de profundidade. A preferência por qPCR de alto rendimento, utilizando matrizes dinâmicas é devido ao facto de ARNm obtido a partir de núcleos cerebrais seguinte paradigmas comportamentais é frequentemente de quantidades limitantes. Matrizes dinâmicas fornecer uma plataforma que permite a análise global eficiente dos transcritos de um grande número de amostras em paralelo numa única experiência. Após a aquisição inicial do sistema de microfluidos (vulgarmente uma pu institucionalrchase), as experiências são relativamente baratos para ser executado. Na sequência desta análise, mais consultas das amostras pode ser realizada utilizando as plataformas mais caras para procurar novas transcrições (por microarrays ou RNAseq) com as matrizes dinâmicas proporcionando uma referência abrangente para a garantia da qualidade. Finalmente, para a análise de dados, são utilizados métodos convencionais. Ponteiros específicos a respeito de questões que possam surgir serão discutidos no texto do protocolo.
Este protocolo é mais apropriado para os investigadores interessados em uma investigação completa do seu sistema de interesse, estudando várias condições e repetições. O protocolo também é mais adequado para os investigadores que já afinados (através de microarray ou RNAseq experimentos) em um subconjunto de 50-500 genes de interesse, que eles estão interessados em consultar repetidamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Caracterização de sucesso da expressão gênica do tecido cerebral após paradigmas comportamentais depende de: 1) manejo cuidadoso de ratos durante o paradigma comportamental; 2) dissecção rápida e precisa do tecido de interesse; 3) medidas RNA segura de garantir a integridade do RNA; e 4) O planejamento cuidadoso de primers e delineamento experimental, bem como precisão e atenção aos detalhes na preparação para a análise de qPCR.
O objectivo do processo descrito é a caracteriza…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been funded by the Israel Science Foundation Grant (ISF # 393/12), Israel Centers of Research Excellence Grant (I-CORE 1796/12), German-Israel Foundation Grant (GIF # 2299-2291.1/2011) and the Marie Curie Career Integration Grant (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201). Initial steps in the project were funded by an AXA postdoctoral fellowship to AC. We acknowledge the generous startup funds provided by the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences.
Critical reading by members of the Citri lab is greatly appreciated.
Materials
| Virusol | Oriek Medical | J29D | |
| Isoflurane, USP 100% | MINRAD INC | NDC 60307-110-25 | |
| RNeasy plus Universal Mini Kit | QIAGENE | 73404 | |
| QIAshredder | QIAGENE | 79654 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Invitrogene | AB-4368814 | |
| TE Buffer | Invitrogene | 1355656 | |
| Behaviour Chamber (MDF; 50X45cm) | Self assembled | ||
| Inner Perspex box (30X30cm) | Self assembled | ||
| camera and video recorder | Campden Inst | CMD-80051 | |
| Media Recorder software | Noldus | NDS-NMR3-00M | |
| Iris Scissors | FST | FST-14062-09 | |
| Sagital Brain slicer with a 0.5mm section | Brain Tree Scientific | BS-AL-505S | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | The Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1852048 | |
| Inverted microspun spatula | Bochem Instrument GmbH | 3213 | |
| Biomark HD Reader | Fluidigm | BMHD-BMKHD | |
| Dynamic array Chip for 96.96gene expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 |
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