Разработка IFN-γ ELISPOT Пробирной для оценки вирусом ветряной оспы конкретных клеточный иммунитет Вслед пуповинной крови трансплантации

Summary

Новые поколения функциональных анализов, таких как гамма-интерферона (IFN-γ) ELISpot, которые обнаруживают продукцию цитокинов на уровне одной клетки и обеспечить как количественную и качественную характеристику Т-клеточные ответы могут быть использованы для оценки клеточно-опосредованные иммунные реакции, направленные против ветряной оспы вирус (VZV).

Abstract

Вирус ветряной оспы (ВВО) является одной из основных причин заболеваемости и смертности следующей пупочной трансплантации пуповинной крови (UCBT). По этой причине, противогерпетической профилактика администрируется систематически педиатрических получателей UCBT для предотвращения осложнений, связанных с VZV инфекции, но нет сильного и основанных на доказательствах мнение, что определяет его оптимальную продолжительность. Поскольку T клеточный иммунитет отвечает за контроль VZV-инфекции, оценка VZV воссоздание конкретных ответов Т-клеток следующее UCBT может обеспечить индикацию относительно того, профилактика должна быть сохранена или может быть прекращено. С этой целью VZV специфический гамма-интерферон (IFN-γ) фермент-связанный ImmunoSpot (ELISpot) был разработан анализ для характеристики производства IFN-γ Т-лимфоцитами в ответ на стимуляцию в пробирке с облучаемой живой аттенуированной вакцины VZV. Этот препарат обеспечивает быстрое, воспроизводимое и чувствительное измерение VZV конкретного слокоть иммунитет подходящий для мониторинга воссоздание VZV специфического иммунитета в клинических условиях и оценки иммунологическую реактивность к ВВЗ антигенов.

Introduction

Сначала выполненный в 1989 году, UCBT все шире используется как часть лечении различных опухолевых и неопухолевых заболеваний крови у детей ^1. ВВО является цитопатический человеком alphaherpesvirus который вызывает два различных заболеваний, ветряной оспой (после первичного инфицирования) и опоясывающий лишай (после реактивации). После первичной инфекции, ВВО сохраняется в течение всей жизни хозяина защищенном пределах чувствительных нервов ганглиях задних корешков. Одним из наиболее опасных инфекционных осложнений после UCBT связан с VZV ^2-4. В нашем клиническом центре, в отсутствии VZV профилактики, кумулятивное падение заболевания VZV болезни VZV на 3 года postUCBT составила 46% ^2. У этих больных, заново инфекция или реактивация ВВЗ часто ассоциируется с висцеральной распространения в центральной нервной системе, легких и печени ^5-7. В результате, ацикловир, валацикловир или фамцикловир профилактика обычно управляются с UBПолучатели CT ^8,9. Однако, эта стратегия лечение не принимать во внимание защитный потенциал VZV специфических Т-лимфоциты или кинетики воссоздания VZV конкретных ответов Т-клеток. Потенциальные проблемы, связанные с расширением использования долгосрочных противогерпетических профилактики включают) избыточного лечения пациентов; б) развитие устойчивость к противовирусным препаратам ^10,11; и в) нарушение VZV специфического иммунного восстановления ^12,13. Поскольку обнаружение функциональных VZV специфических Т-лимфоцитов коррелирует с наличием долгосрочного защиты от VZV-инфекции и улучшению клинического исхода ^4,14,15, мониторинг клеточно-опосредованный иммунный ответ, направленные против VZV в течение периода после трансплантации может привести к более рациональному использованию противовирусных лечение, позволяя практикующих врачей, чтобы отличить пациентов, которые больше всего выигрывают от ВВЗ профилактика от тех, чья иммунная система способна контролировать VZV репликации ^4,13.

ИФН-γ ELISpot анализ широко используется для мониторинга клеточных опосредованных иммунных реакций в различных экспериментальных систем и клинических условиях. Пятна образуются после расщепления хромогенного субстрата, создавая видимый осадок и стабильной в месте реакции. Каждый человек место, таким образом, представляет собой след отдельного цитокинов производящих клетки. IFN-γ ELISpot не только измеряет способность отдельных клеток экс виво для получения IFN-γ в ответ на стимуляцию в пробирке с антигеном, но она также обеспечивает оценку частоты реагирует клетки в данной популяции клеток ^16,17. В дополнение к своей высокой чувствительности, IFN-γ ELISpot проста для выполнения, что делает возможным его использование в контексте персональной клинических протоколов, направленных на руководящих инициирование или прекращение противовирусного лечения. Процедура подробно описаны ниже описания тогоэс анализ ELISpot, которая специально предназначена для обнаружения и измерения производство IFN-γ на мононуклеарных клеток периферической крови после стимуляции в пробирке с ВВО, полученных антигенов.

Protocol

Этот протокол исследования был одобрен Советом по Институциональная Этика рассмотрению CHU Sainte-Justine, Монреаль, Квебек, Канада, где проводилось исследование. Информированное согласие было запрошено и получено от всех участников исследования, их родителей или законных опекунов. Все проц?…

Representative Results

IFN-γ ELISpot протокол описано выше был разработан и оптимизирован в нашей лаборатории, чтобы измерить величину и качество клеток, опосредованных иммунных ответов, направленных против VZV 4. Различные источники VZV антигена может быть использован на стадии стимуляции. К ним относятся: а) …

Discussion

Изменения и устранение неисправностей: ИФН-γ ELISPOT анализы были использованы для изучения клеточно-опосредованные иммунные реакции, направленные против различных патогенных микроорганизмов, в том числе вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) ^24,25, вирус гепатита С (HCV) ^{26, 27</su…}

Materials

Leucocep tube	VWR	89048-936/89048-932	12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	Protect from light.
Benzonase nuclease	Novagen	70746-3	Keep at -20 C.
MultiScreenHTS-IP Filter Plate	Millipore	MSIPS4W10	Sterile with pore size of 0.45 µm.
Mouse anti-human IFN-γ capture antibody	BD Biosciences	551221	NIB42 clone.
Pepmix VZV IE63	JPT Peptide Technologies	PM-VZV-IE63	Dissolve contents of one vial in 40 μL of DMSO. Use within 6 months.
Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody	BD Biosciences	554550	4SB3 clone.
Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase	Bio-Rad Life Science	170-3554	Dilute for use on the same day.
BCIP/NBT	Bio-Rad Life Science	170-6432	Protect from light.