Udvikling af en IFN-γ ELISpot Assay til Vurdere varicellazostervirus-specifik cellemedieret immunitet Efter navlestrengsblod transplantation

Summary

Nye generationer af funktionelle assays, såsom gamma-interferon (IFN-γ) ELISpot, som opdager cytokinproduktion på enkelt celle niveau og giver både kvantitativ og kvalitativ karakterisering af T-cellereaktioner kan anvendes til at vurdere cellemedierede immunreaktioner rettet mod varicella zoster virus (VZV).

Abstract

Varicella zoster virus (VZV) er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed efter navlestrengsblod transplantation (UCBT). Af denne grund er antiherpetic profylakse administreres systematisk til pædiatriske UCBT modtagerne til at forebygge komplikationer forbundet med VZV infektion, men der er ingen stærk, evidensbaseret konsensus, der definerer sin optimale varighed. Fordi T-celle medieret immunitet er ansvarlig for kontrollen af ​​VZV infektion, vurderer rekonstituering af VZV-specifikke T-celle responser efter UCBT kunne give oplysninger om, hvorvidt profylakse bør opretholdes eller kan ophøre. Til dette formål blev en VZV specifikt gamma interferon (IFN-γ) enzym-linked immunospot (ELISpot) assay udviklet til at karakterisere IFN-γ-produktion af T-lymfocytter som respons på in vitro-stimulering med bestrålede levende svækket VZV-vaccine. Denne analyse giver en hurtig, reproducerbar og følsom måling af VZV specifik cell medieret immunitet er egnet til overvågning af rekonstituering af VZV specifik immunitet i en klinisk indstilling og vurdere immunforsvar til VZV-antigener.

Introduction

Uropført i 1989 UCBT stigende grad anvendes som en del af behandlingen af forskellige neoplastiske og nonneoplastic blodsygdomme i børn ^1. VZV er en cytopatisk humant alphaherpesvirus som forårsager to forskellige sygdomme, skoldkopper (efter primær infektion) og herpes zoster (efter reaktivering). Efter primær infektion, VZV fortsætter gennem hele livet af værten i læ inden sensoriske nerver af dorsalrodsganglier. En af de mest truende infektiøse komplikationer efter UCBT er forbundet med VZV ^2-4. I vores kliniske center i mangel af VZV profylakse den kumulative incidens af VZV sygdom VZV sygdom efter 3 år postUCBT var 46% ^2. Hos disse patienter er de novo infektion med eller reaktivering af VZV ofte forbundet med visceral formidling til det centrale nervesystem, lunger og lever ^5-7. Som et resultat, acyclovir, valacyclovir eller famciclovir profylakse almindeligvis administreres til UBCT modtagere ^8,9. Men denne behandlingsstrategi ikke hensyn til den beskyttende potentiale af VZV-specifikke T-lymfocytter eller kinetikken af ​​rekonstituering af VZV-specifikke T-celle-responser. Potentielle problemer i forbindelse med den stigende anvendelse af langsigtede antiherpetic profylakse omfatter a) patient overbehandling; b) udvikling af antiviral resistens ^10,11; og c) forringelse af VZV specifik immun rekonstituering ^12,13. Fordi påvisning af funktionelle VZV-specifikke T-lymfocytter korrelerer med tilstedeværelsen af langsigtet beskyttelse fra VZV infektion og forbedret klinisk resultat ^4,14,15, overvågning cellemedieret immunrespons rettet mod VZV under transplantationen periode kan resultere i en mere rationel anvendelse af antiviral behandling ved at give læger til at skelne patienter, der vil have gavn af VZV profylakse fra dem, hvis immunsystem er i stand til at styre VZV replikation ^4,13.

IFN-γ ELISpot analysen er almindeligt anvendt til overvågning celle-medierede immunreaktioner i en række forskellige eksperimentelle systemer og kliniske tilstande. Steder genereres efter spaltning af et kromogent substrat, der genererer et synligt og stabilt bundfald på stedet af reaktionen. Hver enkelt plet derved repræsenterer fodaftryk af en individuel cytokin-producerende celle. IFN-γ-ELISpot ikke kun måler evnen af de enkelte celler ex vivo til at producere IFN-γ som respons på in vitro-stimulering med dertil hørende antigen, men det giver også et estimat af frekvensen af reagerer celler i en given cellepopulation ^16,17. Ud over sin høje følsomhed, IFN-γ-ELISpot er ligetil at udføre, hvilket gør dets anvendelse mulig i forbindelse med personlige kliniske protokoller formål at vejlede påbegyndelse eller ophør af antiviral behandling. Proceduren beskrevet nedenfor describes et ELISpot-assay, der er specielt designet til at detektere og måle produktionen af IFN-γ af perifert blod mononukleære celler efter in vitro stimulering med VZV afledte antigener.

Protocol

Denne forskning protokol blev godkendt af Institutional Ethics Review Board of CHU Sainte-Justine, Montreal, Quebec, Canada, hvor undersøgelsen blev gennemført. Informeret samtykke blev søgt og fået fra alle undersøgelsens deltagere, deres forældre eller værger. Alle procedurer udføres på dag 1 og 2 skal udføres under sterile forhold (dvs. under en laminar flow hætte). Standard sikkerhedsprocedurer for håndtering af humant blod, bør overholdes nøje. 1.. Coating platter <…

Representative Results

IFN-γ-ELISpot-protokollen beskrevet ovenfor blev udviklet og optimeret i vores laboratorium til måling af størrelsen og kvaliteten af cellemedierede immunreaktioner rettet mod VZV 4. Forskellige kilder til VZV-antigen kan anvendes til stimulering trin. Disse omfatter: a) kommercielt tilgængelig vaskemiddel inaktiverede uddrag fra VZV inficerede Vero-celler 18; b) puljer af overlappende syntetiske peptider fra bestemte VZV kodede proteiner, herunder IE63 15 og ORF4 19; c) l…

Discussion

Ændringer og fejlfinding: IFN-γ-ELISpot-assays er blevet anvendt til at undersøge cellemedierede immunreaktioner rettet mod en række af mikrobielle patogener, herunder human immundefekt virus type 1 (HIV-1) ^24,25, hepatitis C-virus (HCV) ^{26, 27,} og Mycobacterium tuberculosis ^28,29, bare for at nævne et par stykker. Her beskrev vi udviklingen af ​​en IFN-γ ELISpot assay til måling af cellulær immunitet mod, med håbet om at definere korrelater til VZV specifik immun r…

Materials

Leucocep tube	VWR	89048-936/89048-932	12 ml or 50 ml tubes may be used depending on the volume of blood.
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-1440-02	Protect from light.
Benzonase nuclease	Novagen	70746-3	Keep at -20 C.
MultiScreenHTS-IP Filter Plate	Millipore	MSIPS4W10	Sterile with pore size of 0.45 µm.
Mouse anti-human IFN-γ capture antibody	BD Biosciences	551221	NIB42 clone.
Pepmix VZV IE63	JPT Peptide Technologies	PM-VZV-IE63	Dissolve contents of one vial in 40 μL of DMSO. Use within 6 months.
Biotin-conjugated anti-IFN-γ monoclonal antibody	BD Biosciences	554550	4SB3 clone.
Streptavidin conjugated with alkaline phosphatase	Bio-Rad Life Science	170-3554	Dilute for use on the same day.
BCIP/NBT	Bio-Rad Life Science	170-6432	Protect from light.