Une nouvelle méthode de clarification de visualiser biliaire dégénérescence Pendant foie métamorphose de la lamproie marine ( Petromyzon marinus)
Summary
La lamproie marine perdre la vésicule biliaire et des voies biliaires au cours de la métamorphose, un processus similaire à l'atrésie biliaire humaine. Une nouvelle méthode de fixation et de clarification (CLARITY) a été modifié pour visualiser l'ensemble de l'arbre biliaire en utilisant la numérisation laser microscopie confocale. Cette méthode fournit un outil puissant pour étudier la dégénérescence biliaire.
Abstract
Atrésie des voies biliaires est une maladie rare de l'enfance, avec une fréquence d'environ 1 à 15 000 dans le sud-est des États-Unis, mais plus fréquente dans les pays en Asie de l'Est, avec une fréquence déclarée de 1 à 5000 à Taiwan. Bien que beaucoup est connu au sujet de la gestion de l'atrésie des voies biliaires, sa pathogénie est encore insaisissable. La lamproie marine (Petromyzon marinus) offre une occasion unique d'examiner le mécanisme et la progression de la dégénérescence des voies biliaires. La lamproie marine développer à travers trois étapes de la vie distincts: larves, parasites, et adultes. Lors du passage de larves à des mineurs parasite, la lamproie marine subir la métamorphose de la réorganisation dramatique et le remodelage de la morphologie externe et les organes internes. Dans le foie, l'ensemble du système biliaire est perdu, y compris la vésicule biliaire et des voies biliaires. Une méthode nouvellement développé appelé «clarté» a été modifié pour clarifier l'ensemble du foie et la jonction avec l'intestin dans métamorphique lamproie marine. Laprocessus de dégénérescence biliaire a été visualisée et discerné lors de la lamproie marine métamorphose en utilisant la numérisation laser microscopie confocale. Cette méthode fournit un outil puissant pour étudier atrésie des voies biliaires dans un modèle animal unique.
Introduction
La lamproie marine se développer à travers trois étapes distinctes vie 1,2. Larvaire lamproie (L) passent plus de temps dans des terriers comme filtreurs benthiques. Après avoir traversé sept étapes métamorphiques de changements dramatiques dans la morphologie externe et la réorganisation des organes internes 3, les mineurs résultant (JV) entrent dans un stade parasitaire au cours de laquelle ils se nourrissent de sang et les liquides tissulaires de poisson hôte, l'augmentation de la masse corporelle de plus de 100 fois . Après 1.0 à 1,5 ans d'alimentation sur le poisson hôte dans l'océan ou les grands lacs, les adultes cessent de s'alimenter au début du printemps et migrent dans les rivières pour frayer et mourir 1,2.
Au cours de métamorphose, le foie de la lamproie marine perd la vésicule biliaire et l'ensemble de l'arbre biliaire, un phénotype mutant évolutif qui imite la maladie infantile humaine atrésie des voies biliaires. Atrésie des voies biliaires infantile est une maladie du foie pédiatrique rare avec de graves complications médicales 4,5,6,7, 8,9,10, mais la pathogénie et l'étiologie de l'atrésie des voies biliaires sont en grande partie inconnus 4. Les patients présentant une atrésie des voies biliaires meurent dans les deux ans après la naissance, sauf si une intervention chirurgicale (procédure Kasai) est effectuée 5. Par la suite, ces patients ont besoin d'une vaste prise en charge clinique et souvent une transplantation du foie 6. De nombreuses théories de l'atrésie des voies biliaires étiopathogenèse ont été proposées, telles que l'infection virale, une malformation congénitale, maladie auto-immune, et insulte toxique. Toutefois, la contribution de chacun à l'élaboration d'atrésie des voies biliaires restent peu concluantes 7,8,9,10.
Contrairement nourrissons qui souffrent atrésie des voies biliaires pathologique, la lamproie marine subir de développement programmé atrésie des voies biliaires sans necroinflammation vaste, fibrose ou de cirrhose 10. Les animaux peuvent souffrir cholestase transitoire pendant ce processus 10, mais s'adapter à cet état de développementpar l'intermédiaire de la synthèse de novo et de la sécrétion de sels biliaires dans l'intestin après l'atrésie biliaire développementale, en plus des mécanismes connus tels que la réduction de la synthèse des sels biliaires dans le foie 11. Ce processus de développement dans la grande lamproie marine fournit la seule occasion connue pour examiner la progression de l'atrésie des voies biliaires.
Une méthode nouvellement développé appelé «clarté» permet imagerie à haute résolution dans les systèmes nerveux des mammifères complexes en transformant tissu intact dans un hydrogel nanoporeux optiquement transparent 12. Utilisation de la lamproie marine foie et un protocole de CLARITY modifié, l'imagerie des tissus intacts de la dégénérescence biliaire peut être documentée tout au long de la métamorphose du foie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole est modifié à partir d'une nouvelle méthode appelée «clarté» 12, qui réticule tissu intact avec polyacrylamide pour former un hydrogel nanoporeux, puis supprime le membrane plasmique des tissus pour assurer la transparence optique et la perméabilité macromoléculaire. «Clarté» permet l'imagerie des tissus intacts de projection à long terme et le câblage du circuit local dans le système nerveux. Cette nouvelle méthode peut être utilisée pour visualiser l'ensemble du …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs reconnaissent la contribution de la Station biologique de Hammond Bay, Great Lakes Science Center, US Geological Survey. Nous remercions également le Dr Melinda cadre au Centre de microscopie avancée à l'Université d'État du Michigan pour son soutien technique à balayage laser microscopie confocale. Cette étude est financée par des subventions de la Commission des pêcheries des Grands Lacs à YWCD et WML.
Materials
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
Riferimenti
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