Un metodo Chiarimento Nuovo per visualizzare biliare degenerazione Durante fegato Metamorfosi in mare Lamprey ( Petromyzon marinus)
Summary
Lampreda di mare perde la cistifellea e vie biliari durante la metamorfosi, un processo simile a atresia biliare umano. Un nuovo metodo di fissazione e chiarificazione (CLARITY) è stato modificato per visualizzare l'intero albero biliare mediante scansione laser microscopia confocale. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare la degenerazione biliare.
Abstract
Atresia biliare è una rara malattia dell'infanzia, con una stima di 1 a 15.000 frequenza nel sud-est degli Stati Uniti, ma più comune nei paesi dell'Asia orientale, con una frequenza riportata di 1 su 5.000 in Taiwan. Anche se si sa molto circa la gestione di atresia biliare, la sua patogenesi è ancora sfuggente. La lampreda di mare (Petromyzon marinus) offre un'opportunità unica per esaminare il meccanismo e la progressione della degenerazione biliare. Lampreda di mare sviluppare attraverso tre fasi della vita distinte: larve, parassiti, e adulti. Durante la transizione da larve di parassiti giovanile, lampreda di mare subiscono metamorfosi con la riorganizzazione drammatica e rimodellamento in morfologia esterna e gli organi interni. Nel fegato, l'intero sistema biliare è perso, compresa la cistifellea e l'albero biliare. Un metodo di nuova concezione denominato "CHIAREZZA" è stata modificata per chiarire l'intero fegato e il bivio con l'intestino in metamorfico lampreda di mare. Ilprocesso di degenerazione biliare è stato visualizzato e discernimento durante la lampreda di mare metamorfosi mediante scansione laser microscopia confocale. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare atresia biliare in un modello animale unico.
Introduction
Lampreda di mare si sviluppano attraverso tre distinte fasi di vita di 1,2. Larvale lampreda di mare (L) trascorrono più tempo in tane come filtratori bentonici. Dopo aver attraversato sette stadi metamorfici di drammatici cambiamenti nella morfologia e riorganizzazione in organi interni 3 esterni, il novellame risultanti (JV) entrano in una fase parassitaria nel corso della quale si nutrono di sangue e fluidi tissutali di pesce ospitante, l'aumento della massa corporea più di 100 volte . Dopo la 1.0 to 1,5 anni di alimentazione sul pesce ospite in mare o grandi laghi, adulti cessano alimentazione durante la primavera e migrano nei fiumi per deporre le uova e poi muoiono 1,2.
Durante la metamorfosi, il fegato lampreda di mare perde la cistifellea e l'intero albero biliare, un fenotipo mutante evolutivo che imita la malattia neonato umano atresia delle vie biliari. Infant atresia biliare è una rara malattia del fegato pediatrico a gravi complicazioni mediche 4,5,6,7, 8,9,10, ma la patogenesi ed eziologia di atresia biliare sono in gran parte sconosciuti 4. I pazienti con atresia biliare muoiono entro due anni dopo la nascita se non viene eseguito l'intervento chirurgico (procedura Kasai) 5. Successivamente, questi pazienti richiedono una gestione clinica e spesso trapianto di fegato 6. Molte teorie di atresia biliare eziopatogenesi sono stati proposti, come l'infezione virale, malformazione congenita, malattia autoimmune, e insulto tossico. Tuttavia, il contributo di ciascuno allo sviluppo di atresia biliare rimane inconcludente 7,8,9,10.
A differenza dei bambini che soffrono patologico atresia delle vie biliari, lampreda di mare che formano oggetto evolutivamente programmato atresia delle vie biliari senza una necroinfiammazione, fibrosi o cirrosi 10. Gli animali possono soffrire colestasi transitorio durante questo processo 10, ma adattarsi a questa condizione dello sviluppovia de novo sintesi e secrezione di sali biliari nell'intestino dopo sviluppo atresia biliare, oltre ai meccanismi noti come la riduzione della sintesi di sali biliari nel fegato 11. Questo processo di sviluppo in lampreda di mare offre l'opportunità unica nota di esaminare la progressione di atresia biliare.
Un metodo di nuova concezione denominato "CHIAREZZA" permette di imaging ad alta risoluzione in complessi sistemi nervosi dei mammiferi trasformando tessuto intatto in un idrogel nanoporosa otticamente trasparente 12. Utilizzando mare fegato lampreda e un protocollo CLARITY modificato, imaging intatto tessuto della degenerazione biliare può essere documentata in tutta metamorfosi fegato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo è modificato da un nuovo metodo chiamato "chiarezza" 12, che reticola tessuto intatto con poliacrilammide per formare un idrogel nanoporoso, e poi strappa via la membrana plasmatica del tessuto per ottenere la trasparenza ottica e permeabilità macromolecolare. "CHIAREZZA" permette l'imaging intatto tessuto di lungo raggio di proiezione e il cablaggio del circuito locale nel sistema nervoso. Questo nuovo metodo può essere usato per visualizzare l'intero sistema …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il contributo della stazione Hammond Bay biologica, Great Lakes Science Center, US Geological Survey. Ringraziamo anche il Dott. Melinda frame presso il Centro di Microscopia Avanzata presso la Michigan State University per il suo supporto tecnico nella scansione laser microscopia confocale. Questo studio è sostenuto da finanziamenti della Commissione Grandi Laghi per la pesca a YWCD e WML.
Materials
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
Riferimenti
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