En ny Avklaring metode for å visualisere Galle Degeneration Under Liver Metamorphosis i Sea Lamprey ( Petromyzon marinus)

Summary

Sea lamprett mister galleblære og galleganger under metamorfose, en prosess som ligner på menneskets biliær atresi. En ny fiksering og avklaring metode (CLARITY) ble endret for å visualisere hele galletreet ved hjelp av laserskanning konfokalmikroskopi. Denne metoden gir et kraftig verktøy for å studere galle degenerasjon.

Abstract

Biliær atresi er en sjelden sykdom i barndommen, med anslagsvis 1 i 15 000 frekvens i sørøst USA, men mer vanlig i østasiatiske land, med en rapportert frekvens av en i 5000 i Taiwan. Selv om mye er kjent om forvaltningen av galle atresi, er dens patogenesen fortsatt unnvikende. Havet lamprett (Petromyzon marinus) gir en unik mulighet til å undersøke mekanismen og progresjon av galle degenerasjon. Sea lamprett utvikle seg gjennom tre forskjellige livsstadier: larve, parasittiske, og voksne. I overgangen fra larver til parasittiske juvenile, sjø lamprett gjennomgå metamorfose med dramatisk omorganisering og ombygging i ytre morfologi og indre organer. I leveren, er hele gallesystemet tapt, inkludert galleblæren og galle treet. En nyutviklet metode kalt "CLARITY" ble endret for å klargjøre hele leveren og krysset med tarmen i metamorfe havet niøye. Denprosessen med galle degenerasjon ble visualisert og skjelnet under havet lamprett metamorfose ved hjelp av laser scanning konfokalmikroskopi. Denne metoden gir et kraftig verktøy for å studere biliær atresi i en unik dyremodell.

Introduction

Sea lamprett utvikle seg gjennom tre distinkte livsstadier ^1,2. Larve havet lamprett (L) tilbringer mest tid i hulene som bunndyr filter feeders. Etter å ha gått gjennom syv metamorfe stadier av dramatiske endringer i ytre morfologi og omorganisering i indre organer ^3, de resulterende yngel (JV) angir en parasittisk stadium der spiser de blod og vevsvæsker fra vertsfisk, øke kroppsmassen mer enn 100 ganger . Etter 1,0 til 1,5 år fôring på vertsfisk i havet eller store innsjøer, voksne opphøre fôring i løpet av den tidlige våren og vandrer ut i elvene for å gyte, og deretter dør ^1,2.

Under metamorfosen, mister havet lamprett leveren galleblæren og hele galletreet, en evolusjonær mutant fenotype som etterligner den menneskelige spedbarn sykdom biliær atresi. Infant biliær atresi er en sjelden pediatrisk leversykdom med alvorlige medisinske komplikasjoner ^4,5,6,7, 8,9,10, men patogenesen av og årsak til galle atresi er i stor grad ukjent ^fire. Pasienter med galle atresi dør innen to år etter fødselen med mindre kirurgisk inngrep (Kasai prosedyre) utføres ^fem. Deretter disse pasientene krever omfattende klinisk ledelse og ofte levertransplantasjon ^seks. Mange teorier om galle atresi etiopathogenesis har blitt foreslått, for eksempel viral infeksjon, medfødte misdannelser, autoimmun sykdom, og giftige fornærmelse. Men bidraget fra hver til utvikling av galle atresi er fortsatt mangelfulle ^7,8,9,10.

I motsetning til spedbarn som lider patologisk biliær atresi, gjennomgå havet lamprett utviklingshemmede programmert biliær atresi uten omfattende necroinflammation, fibrose eller cirrhose ^10. Dyrene kan lide transient kolestase i løpet av denne prosessen ^10, men tilpasser seg dette utviklingstilstandvia de novo syntesen og sekresjon av gallesalter i tarmen etter utviklings biliær atresia, i tillegg til kjente mekanismer som for eksempel reduksjon av gallesalt-syntese i leveren ^11. Denne utviklingsprosessen i sjø lamprett gir den eneste kjente mulighet til å undersøke utviklingen av galle atresi.

En nyutviklet metode kalt "CLARITY" gir høy oppløsning bildebehandling i komplekse pattedyr nervesystem ved å forvandle intakt vevet inn en optisk gjennomsiktig nanoporøse hydrogel ^12. Bruke havet lamprett leveren og en modifisert CLARITY protokoll, kan dokumenteres intakt-vev avbildning av galle degenerasjon gjennom leveren metamorfose.

Protocol

1. Løsning Forberedelse Lag 1 L 10x 0,1 M fosfatbuffer saltvannsoppløsning (PBS, pH 7,4): veie 26,2 g natriumfosfat (monobasisk), 115 g natriumfosfat (dibasisk), og 87,66 g NaCl. Løs opp i ca 800 ml destillert H 2 O, justere pH, og bringe volumet opp til en L med destillert H 2 O. Lag 1 L 0,1 M fosfatbuffer saltvannsoppløsning (pH 7,4): ta 100 ml 10 x PBS, og tilsett 900 ml destillert H-2 O. Lag 1 L 0,1 M fosfatbuffer saltvannsoppløsning (pH 7,4) med 0,…

Representative Results

Flere viktige utviklings hendelser oppstår i hepatobiliært systemet under havet lamprett metamorfose. Den gallegang og galleblæren gjennomgå apoptose og degenerert (Figur 1). Kombinere den modifiserte avklaring metoden og farging med levercelle markør cytokeratin 19 (CK19, til stede i begge cholangiocytes og hepatocytter før og etter metamorfose 13) og anti-apoptotisk markør BCL2 hjelp konfokalmikroskopi, ble hele galle systemet fanget langs Z-aksen ( figur 2), og den …

Discussion

Denne protokollen er modifisert fra en ny metode kalt "klarhet" ^12, som kryssbinder intakt vev med polyakrylamid for å danne en nanoporøse hydrogel og deretter strimler bort plasmamembranen av vevet for å oppnå optisk transparens og makromolekylær permeabilitet. "CLARITY" lar intakt-vev avbildning av langtrekkende projeksjon og lokale krets ledningsnett i nervesystemet. Denne nye fremgangsmåte kan anvendes til å visualisere hele gallesystemet i sjø lamprett leveren under metamorfos…

Materials

40% acrylamide	Bio-Rad	161-0140
2% bis-acrylamide	Bio-Rad	161-0142
TEMED	Bio-Rad	161-0800
ammonium persulfate	Sigma	A3678-25G
boric acid	Sigma	B7901-1KG
saponin	Sigma	47036
sodium dodecyl sulfate	Sigma	L337-500G
sodium phosphate (monobasic)	Sigma	04269-1KG
sodium phosphate (dibasic)	Sigma	S5136-1KG
Triton X-100	Sigma	X100-500ML
glycerol	Sigma	G9012-500ML
16% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15710-S
NaOH pellets	EMD	SX0590-3
15 ml centrifuge tubes	Any brand
dissecting tools	Any brand