Um Método de Esclarecimento Novo para Visualize biliar Degeneração Durante fígado metamorfose em lampreia de mar ( Petromyzon marinus)
Summary
Mar lampreia perder a vesícula e canais biliares durante a metamorfose, um processo semelhante à atresia biliar humano. Um novo método de fixação e esclarecimento (clareza) foi modificado para visualizar toda a árvore biliar através de microscopia confocal de varredura a laser. Este método fornece uma ferramenta poderosa para o estudo degeneração biliar.
Abstract
A atresia biliar é uma doença rara da infância, com uma estimativa de 1 em 15.000 freqüência no sudeste dos Estados Unidos, mas é mais comum em países do leste asiático, com uma freqüência relatada de 1 em 5000 em Taiwan. Embora muito se sabe sobre a gestão da atresia biliar, sua patogênese ainda é indescritível. A lampreia mar (Petromyzon marinus) oferece uma oportunidade única para examinar o mecanismo e progressão da degeneração biliar. Mar lampreia desenvolver através de três fases da vida distintas: larval, parasitárias e adultos. Durante a transição de larva para juvenil parasitária, lampreia de mar sofrem metamorfose com reorganização dramática e remodelação na morfologia externa e órgãos internos. No fígado, a totalidade do sistema biliar é perdida, incluindo a vesícula biliar e das vias biliares. Um método recém-desenvolvido chamado "clareza" foi modificado para esclarecer todo o fígado e na junção com o intestino em lampreia mar metamórfica. Oprocesso de degeneração das vias biliares foi visualizado e discernir durante lampreia metamorfose mar por meio de microscopia confocal de varredura a laser. Este método fornece uma ferramenta poderosa para o estudo de atresia biliar em um modelo animal único.
Introduction
Lampreia Mar desenvolver-se através de três fases distintas de vida 1,2. Lampreia mar larval (L) passam a maior parte do tempo em tocas como filtradores bentónicos. Depois de passar por sete estágios metamórficos de mudanças dramáticas na morfologia externa e reorganização em órgãos internos 3, os juvenis resultantes (JV) entrar numa fase parasitária durante o qual eles se alimentam de sangue e fluidos de tecido de peixe hospedeiro, aumentando a massa corporal mais de 100 vezes . Depois de 1,0 a 1,5 anos se alimentando no peixe hospedeiro no mar ou grandes lagos, os adultos deixam alimentação durante o início da primavera e migram para os rios para desovar e morrer 1,2.
Durante a metamorfose, o fígado lampreia mar perde a vesícula biliar e toda a árvore biliar, um fenótipo mutante evolutivo que imita a doença bebê humano atresia biliar. Atresia biliar infantil é uma doença hepática pediátrica rara, com graves complicações médicas 4,5,6,7, 8,9,10, no entanto, a patogênese e etiologia da atresia de vias biliares são em grande parte desconhecida 4. Os pacientes com atresia biliar morrer dentro de dois anos após o nascimento, a menos que a intervenção cirúrgica (cirurgia de Kasai) é realizada 5. Posteriormente, estes pacientes necessitam de extensa gestão clínica e muitas vezes o transplante de fígado 6. Muitas teorias de etiopatogenia atresia biliar têm sido propostas, como infecção viral, malformação congênita, doença auto-imune, e insulto tóxico. No entanto, a contribuição de cada um para o desenvolvimento de atresia biliar permanece inconclusiva 7,8,9,10.
Ao contrário de crianças que sofrem atresia biliar patológico, lampreia de mar sofrem programada pelo desenvolvimento atresia biliar sem necroinflammation extensa, fibrose ou cirrose 10. Os animais podem sofrer colestase transitória durante este processo de 10, mas se adaptar a esta condição de desenvolvimentoVia de síntese de novo e secreção de sais biliares no intestino, após a atresia biliar de desenvolvimento, para além de mecanismos conhecidos, tais como a redução da síntese de sais biliares no fígado 11. Este processo de maturação na lampreia mar oferece a oportunidade única conhecida para analisar a progressão da atresia biliar.
Um método recém-desenvolvido chamado "clareza" permite imagens de alta resolução no sistema nervoso de mamíferos complexos, transformando tecido intacto em um hidrogel nanoporous opticamente transparente 12. Usando lampreia fígado mar e um protocolo CLAREZA modificado, de imagem de tecido intacto de degeneração biliar pode ser documentada em toda metamorfose fígado.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo modificado a partir de um novo método denominado "clareza" 12, que reticula tecido intacto com poliacrilamida para formar um hidrogel nanoporoso, e depois tira da membrana plasmática de tecidos para alcançar a transparência óptica e a permeabilidade de macromoléculas. "Clareza" permite imagens de tecidos intactos de projeção de longo alcance e fiação do circuito local no sistema nervoso. Este novo método pode ser usado para visualizar todo o sistema biliar no fíg…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores reconhecem a contribuição da Estação Biológica Hammond Bay, Great Lakes Science Center, EUA Geological Survey. Agradecemos também a Dr. Melinda quadro do Centro de Microscopia Avançada na Universidade Estadual de Michigan pelo apoio técnico em microscopia confocal de varredura a laser. Este estudo é suportado por concessões do Great Lakes Comissão das Pescas para YWCD e WML.
Materials
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| ammonium persulfate | Sigma | A3678-25G | |
| boric acid | Sigma | B7901-1KG | |
| saponin | Sigma | 47036 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma | L337-500G | |
| sodium phosphate (monobasic) | Sigma | 04269-1KG | |
| sodium phosphate (dibasic) | Sigma | S5136-1KG | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500ML | |
| glycerol | Sigma | G9012-500ML | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710-S | |
| NaOH pellets | EMD | SX0590-3 | |
| 15 ml centrifuge tubes | Any brand | ||
| dissecting tools | Any brand |
Riferimenti
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