Mätning av det osmotiska Vatten permeabilitetskoefficienten (P<sub> F</sub>) Av Sfäriska Celler: isolerade växtprotoplaster som exempel
Summary
Mätning av osmotiska vatten permeabilitetskoefficienten (P f) av celler kan hjälpa till att förstå de regler hos aquaporiner (AQPs). P f beslutsamhet i sfäriska växtcellprotoplaster som presenteras här innebär protoplaster isolering och numerisk analys av deras initial hastighet på volymförändringar till följd av en osmotisk utmaning under konstant bad perfusion.
Abstract
Studera AQP regleringsmekanismer är avgörande för förståelsen av vattenförbindelser på både cellulära och hela växtnivåer. Presenterad här är en enkel och mycket effektiv metod för bestämning av den osmotiska vatten permeabilitetskoefficienten (P f) i växtprotoplaster, som tillämpas i princip även andra sfäriska celler såsom grodoocyter. Det första steget i analysen är isoleringen av protoplaster från växtvävnaden av intresse genom enzymatisk digerering i en kammare med en lämplig isoton lösning. Det andra steget består av en osmotisk utmaning analys: protoplaster immobiliserade på botten av kammaren utsätts för en konstant perfusion börjar med en isoton lösning och följs av en hypoton lösning. Cell svullnad är video inspelad. I det tredje steget, är bilderna bearbetas offline för att ge volymförändringar, och tidsförloppet av volymförändringar är korrelerad med tidsförloppet av förändringen i osmolahet av kammaren perfusionsmediet, med användning av en kurvanpassningsförfarandet skriven i Matlab (den "PfFit '), för erhållande av Pf.
Introduction
Vattenupptagning och flöde över cellmembran är en grundläggande förutsättning för växt existens både på cellulär och hela växtnivåer. På cellnivå, aquaporiner (AQPs) spelar en viktig roll i regleringen av det osmotiska vatten permeabilitetskoefficienten (P f) i cellmembranet 1-3.
Hittills har flera metoder använts för att mäta den endogena P f av protoplast från olika växtorgan (dvs. rötter, mesophyll, endodermis, osv., Granskats av Chaumont et al. 4). En av de metoder för att mäta P f är att exponera protoplastema till en osmotisk utmaning och att övervaka initial hastighet på sin volymförändring (dvs., Lutningen på den tidiga linjära fasen av volymförändring). Två olika metoder har tidigare beskrivits utifrån detta synsätt, båda baserade på en momentan utbyte av lösningar. Den första en består av immobilizing av protoplast med ett sug mikropipett och omkoppling av vätskeflödet 5 och den andra att överföra protoplast från en lösning till en annan med hjälp av en mikropipett 6. Dessa mikropipett sug och mikropipett överföra metoder, som möjliggör bildtagning genast i början av den snabba lösningen utbyte (att fånga den tidiga linjära fasen av volymförändring), sannolikt innebära en fysisk stress till protoplaster och kräver specialiserad utrustning och expertmikromanipulering.
Den här beskrivna metoden minimerar störning till cellerna, innebär inga mikromanipulering och tillåter härledning av P f när badet perfusionen är inte ögonblicklig.
Efter den enzymatiska nedbrytning, protoplasterna, nedsänkt i en isoton lösning, är immobiliserade på täckglas botten av en plexiglas (aka Lucite eller plexiglas) kammare med laddnings interaktion. Sedan, under ett konstant bad perfusion,den isotonisk lösning spolas bort av en hypoton lösning genererar en hypoosmotisk utmaning protoplastema. Svullnaden av protoplast är video inspelad och sedan, genom att kombinera information om tidsförloppet för badet perfusion och tidsförloppet för cellsvullnad, är P f bestäms genom bildbehandling och kurvanpassningsförfaranden.
Fördelarna med denna metod är att försöket är mycket effektiv, dvs det är möjligt att följa ett fåtal celler samtidigt i en enda analys, och att det inte kräver speciell utrustning eller speciella mikromanipulering färdigheter. Flera tillämpningar för denna metod är möjliga. Till exempel, bestämning av den nativa P f av en mängd celler från olika vävnader och växter, såsom mesophyll och bunta täckceller från Arabidopsis blad 7, majs blad mesophyll eller rot cortexceller 8-10 eller suspensions odlade celler 11,12. I additiden, är det möjligt att bestämma P f av sfäriska djurceller som äggcell celler 11. Ett annat exempel handlar om granskning av AQP aktivitet genom gående uttryck för deras gen i protoplastema (eller andra gener som kan påverka dem, t.ex., gener av kinaser) och fastställande av deras bidrag till P f; till exempel uttryck av tomat AQP SlTIP2, 2 i Arabidopsis mesophyll protoplaster från PEG omvandling och beslutsamhet för SlTIP2, 2 relaterade P f 13. Slutligen undersökning av effekten på P f olika molekyler / ämnen (läkemedel, hormoner, etc.) till de lösningar kan också undersökas, till exempel på AQP blockerare HgCl2 7.
Följande protokoll beskriver isolering av protoplaster av Arabidopsis mesofyllceller och bestämning av deras Pf.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beskrivs här är en enkel och mycket effektiv procedur för att mäta P f av isolerade växtprotoplaster, som gäller i princip även för andra sfäriska celler, t ex., Grodoocyter 11. Denna metod är baserad på mätning av P f som svar på en osmotisk utmaning till cellen. I motsats till de andra metoder baserade på detta tillvägagångssätt är emellertid förändringen av lösningar, dvs av osmolariteten är inte ögonblicklig, men gradvis, under en konstant bad…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete har finansierats med bidrag från den belgiska nationella fonden för Scientific Research (FNRS), den Interuniversitets sevärdhet polacker Program-belgiska Science Policy och "Communauté française de Belgique-Actions de Recherches Concertées" till FC, från Israel Science Foundation Jerusalem ( ISF) till MM (Grant # 1311-1312) och NM (Grant # 1312-1312).
Materials
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| Plexiglass slide etc. | Perspectiv | http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'. |
|
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
Riferimenti
- Tyerman, S. D., Niemietz, C. M., Bramley, H. Plant aquaporins: multifunctional water and solute channels with expanding roles. Plant Cell Environ. 25, 173-194 (2002).
- Maurel, C. Plant aquaporins: Novel functions and regulation properties. Febs Letters. 581, 2227 (2007).
- Maurel, C., Verdoucq, L., Luu, D. T., Santoni, V. Plant aquaporins: Membrane channels with multiple integrated functions. Annual Review of Plant Biology. 59, 595 (2008).
- Chaumont, F., Moshelion, M., Daniels, M. J. Regulation of plant aquaporin activity. Biology Of The Cell. 97, 749-764 (2005).
- Ramahaleo, T., Morillon, R., Alexandre, J., Lassalles, J. P. Osmotic water permeability of isolated protoplasts. Modifications during development. Plant Physiology. 119, 885-896 (1999).
- Suga, S., Murai, M., Kuwagata, T., Maeshima, M. Differences in aquaporin levels among cell types of radish and measurement of osmotic water permeability of individual protoplasts. Plant Cell Physiol. 44, 277-286 (2003).
- Shatil-Cohen, A., Attia, Z., Moshelion, M. Bundle-sheath cell regulation of xylem-mesophyll water transport via aquaporins under drought stress: a target of xylem-borne ABA?. The Plant Journal. 67, 72-80 (2011).
- Hachez, C., Moshelion, M., Zelazny, E., Cavez, D., Chaumont, F. Localization and quantification of plasma membrane aquaporin expression in maize primary root: A clue to understanding their role as cellular plumbers. Plant Molecular Biology. 62, 305-323 (2006).
- Hachez, C., Heinen, R. B., Draye, X., Chaumont, F. The expression pattern of plasma membrane aquaporins in maize leaf highlights their role in hydraulic regulation. Plant Molecular Biology. 68, 337-353 (2008).
- Besserer, A., et al. Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the SNARE SYP121. The Plant Cell. 24, 3463-3481 (2012).
- Moshelion, M., Moran, N., Chaumont, F. Dynamic changes in the osmotic water permeability of protoplast plasma membrane. Plant Physiology. 135, 2301-2317 (2004).
- Moshelion, M., et al. Membrane water permeability and aquaporin expression increase during growth of maize suspension cultured cells. Plant, Cell & Environment. 32, 1334-1345 (2009).
- Sade, N., et al. Improving plant stress tolerance and yield production: is the tonoplast aquaporin SlTIP2;2 a key to isohydric to anisohydric conversion?. New Phytologist. 181, 651-661 (2009).
- Volkov, V., et al. Water permeability differs between growing and non-growing barley leaf tissues. J. Exp. Bot. 58, 377 (2007).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Reports. 21, 865-871 (2003).
- Hosy, E., Duby, G., Véry, A. A., Costa, A., Sentenac, H., Thibaud, J. B. A procedure for localisation and electrophysiological characterisation of ion channels heterologously expressed in a plant context. Plant Methods. 19, (2005).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human Recombinant Type I Collagen Produced in Plants. Tissue Eng Part A. 19, 1527-1533 (2013).
