Osmotic पानी पारगम्यता गुणांक (पी मापने_च) गोलाकार कोशिकाओं का एक उदाहरण के रूप में अलग संयंत्र protoplasts

Summary

कोशिकाओं की आसमाटिक पानी पारगम्यता गुणांक (पी _एफ) को मापने aquaporins के नियामक तंत्र (AQPs) को समझने में मदद कर सकते हैं. यहाँ प्रस्तुत गोलाकार संयंत्र सेल मूलतत्त्वों में पी _एफ दृढ़ संकल्प मूलतत्त्वों अलगाव और निरंतर स्नान छिड़काव के दौरान एक आसमाटिक चुनौती का एक परिणाम के रूप में मात्रा परिवर्तन के अपने प्रारंभिक दर के संख्यात्मक विश्लेषण शामिल है.

Abstract

AQP विनियमन तंत्र के अध्ययन के सेलुलर और पूरे संयंत्र स्तर दोनों पर पानी संबंधों की समझ के लिए महत्वपूर्ण है. आसमाटिक पानी पारगम्यता गुणांक संयंत्र मूलतत्त्वों में (पी _एफ), ऐसे मेंढक oocytes के रूप में अन्य गोलाकार कोशिकाओं को भी सिद्धांत रूप में लागू के निर्धारण के लिए एक सरल और बहुत ही कुशल विधि यहाँ है प्रस्तुत किया. परख का पहला कदम एक उपयुक्त isotonic समाधान के साथ एक कक्ष में enzymatic पाचन द्वारा ब्याज के संयंत्र के ऊतकों से protoplasts के अलगाव है. दूसरे चरण के लिए एक आसमाटिक चुनौती परख के होते हैं: कक्ष के तल पर स्थिर मूलतत्त्वों एक hypotonic समाधान द्वारा एक isotonic समाधान के साथ एक निरंतर छिड़काव शुरू करने के लिए प्रस्तुत की और पीछा कर रहे हैं. सेल सूजन वीडियो दर्ज की गई है. तीसरे चरण में, छवियों मात्रा परिवर्तन उपज के लिए ऑफ़लाइन कार्रवाई कर रहे हैं, और मात्रा में परिवर्तन के समय पाठ्यक्रम osmola में परिवर्तन के समय के पाठ्यक्रम के साथ जोड़ा जाता हैचैम्बर छिड़काव माध्यम की rity, पी _एफ उपज, Matlab ('PfFit') में लिखा एक वक्र ढाले प्रक्रिया का उपयोग कर.

Introduction

सेलुलर झिल्ली भर पानी तेज और प्रवाह सेलुलर और पूरे संयंत्र दोनों स्तरों पर संयंत्र अस्तित्व के लिए एक बुनियादी आवश्यकता है. सेलुलर स्तर पर, aquaporins (AQPs) कोशिका झिल्ली ^1-3 की आसमाटिक पानी पारगम्यता गुणांक (पी _एफ) के नियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं.

तिथि करने के लिए, कई तरीकों विभिन्न संयंत्र अंगों से मूलतत्त्व की अंतर्जात पी _एफ मापने में नियोजित किया गया है (यानी जड़ों, मेज़ोफिल, इंडोडर्मिस, आदि., Chaumont एट अल. ⁴ द्वारा समीक्षा). पी _एफ मापने के तरीकों में से एक एक आसमाटिक चुनौती को मूलतत्त्वों को बेनकाब करने और इसकी मात्रा परिवर्तन की प्रारंभिक दर पर नजर रखने के लिए है (यानी., मात्रा बदलने की जल्दी रैखिक चरण की ढलान). दो अलग अलग तरीकों पहले से समाधान का एक तात्कालिक एक्सचेंज पर इस दृष्टिकोण के आधार पर वर्णित, दोनों आधारित थे. पहले एक immobiliz के होते हैंएक चूषण micropipette साथ मूलतत्त्व आईएनजी और समाधान प्रवाह ⁵ और एक micropipette ⁶ का उपयोग कर एक दूसरे के समाधान से मूलतत्त्व के हस्तांतरण की एक दूसरे स्विचन. तेजी से समाधान विनिमय के बहुत शुरू में छवि अधिग्रहण की अनुमति जो इन micropipette सक्शन और micropipette स्थानांतरित तरीकों, संभावना मूलतत्त्वों को एक शारीरिक तनाव को शामिल, (मात्रा बदलने की जल्दी रैखिक चरण पर कब्जा करने के लिए) और विशेष उपकरण और विशेषज्ञ micromanipulation की आवश्यकता है.

यहाँ वर्णित विधि कोई micromanipulation शामिल है और स्नान छिड़काव तात्कालिक नहीं है जब पी _एफ की व्युत्पत्ति परमिट, कोशिकाओं को अशांति को कम करता है.

Enzymatic पाचन के बाद, एक isotonic समाधान में डूबे हुए मूलतत्त्वों,, प्रभारी बातचीत से coverslip गिलास एक Plexiglass के नीचे (उर्फ Lucite या कड़ा) चैम्बर पर स्थिर रहे. फिर, एक निरंतर स्नान छिड़काव के दौरान,isotonic समाधान मूलतत्त्वों को एक hypoosmotic चुनौती पैदा एक hypotonic समाधान से दूर प्लावित है. मूलतत्त्व की सूजन वीडियो दर्ज की गई और फिर, स्नान छिड़काव के समय पाठ्यक्रम और सेल सूजन के समय के पाठ्यक्रम के बारे में जानकारी के संयोजन से, पी _एफ इमेज प्रोसेसिंग और वक्र ढाले प्रक्रियाओं द्वारा निर्धारित किया जाता है.

इस विधि का लाभ, प्रयोग बहुत ही कुशल है कि यह एक एकल परख में एक साथ कुछ कोशिकाओं पर नजर रखने के लिए संभव है, और यह विशेष उपकरण या विशेष micromanipulation कौशल की आवश्यकता नहीं है कि अर्थात्. इस विधि के लिए कई आवेदन संभव हो रहे हैं. उदाहरण के लिए, ऐसे मेज़ोफिल के रूप में विभिन्न ऊतकों और पौधों से कोशिकाओं की एक किस्म के देशी पी _एफ के दृढ़ संकल्प और Arabidopsis पत्ता ^7, मक्का पत्ती मेज़ोफिल या जड़ प्रांतस्था कोशिकाओं ^8-10 या निलंबन संवर्धित कोशिकाओं ^11,12 से म्यान कोशिकाओं बंडल. Additi मेंपर, यह इस तरह के oocyte कोशिकाओं के रूप में ¹¹ गोलाकार पशु कोशिकाओं के पी _एफ निर्धारित करने के लिए संभव है. पी _एफ के लिए उनके योगदान की और दृढ़ संकल्प, एक और उदाहरण protoplasts (जैसे, kinases का जीन या किसी भी अन्य जीनों उन्हें प्रभावित कर सकता है) में उनके जीन की क्षणिक अभिव्यक्ति द्वारा AQP गतिविधि की परीक्षा शामिल है; 2 खूंटी परिवर्तन और दृढ़ संकल्प SlTIP2 द्वारा Arabidopsis मेज़ोफिल मूलतत्त्वों में; उदाहरण, टमाटर AQP SlTIP2 की अभिव्यक्ति के लिए ¹³ _एफ पी 2 से संबंधित. अंत में, (आदि दवाओं, हार्मोन,) विभिन्न अणुओं / पदार्थों के पी _एफ पर प्रभाव की परीक्षा भी AQP अवरोधक HgCl ₂ ⁷ के उदाहरण के लिए, जांच की जा सकती समाधान के लिए कहा.

निम्नलिखित प्रोटोकॉल Arabidopsis मेज़ोफिल कोशिकाओं और उनके पी _एफ के दृढ़ संकल्प की protoplasts के अलगाव का वर्णन है.

Protocol

समाधान की 1. तैयारी तैयार isotonic (600 mOsm) और hypotonic 10 मिमी KCl, 1 मिमी 2 CaCl, और युक्त (500 mOsm) समाधान 8 एम 2 (एन morpholine) -ethanesulphonic एसिड (एमईएस), पीएच 5.7 और की उचित मात्रा के साथ परासारिता समायोजित डी sorbitol: isotonic और hypotonic समाधान के लिए 440 मिम…

Representative Results

अलग AQPs की गतिविधि पी एफ का निर्धारण और तुलना करने के लिए, Arabidopsis पत्ती से मेज़ोफिल मूलतत्त्वों किया जाता है. इन मूलतत्त्वों कम बेसल (पृष्ठभूमि) पी एफ स्तर 7 पाया गया और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने य?…

Discussion

यहाँ वर्णित अन्य गोलाकार कोशिकाओं को भी सिद्धांत रूप में लागू पृथक संयंत्र protoplasts के पी _एफ,, उदा., मेंढक oocytes ¹¹ को मापने के लिए एक सरल और बहुत ही कुशल प्रक्रिया है. इस विधि सेल करने के लिए एक आसमाटिक…

Materials

KCl	Chem-Impex International	01247-1	http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade
CaCl2	Merck	11718006	http://www.merck.com Any source, anal. grade
2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES)	Sigma	15152002	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
D-Sorbitol	Sigma	18032003	http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade
Cellulase	Worthington, Lakewood, NJ, USA	LS002603	http://www.worthingtonbiochem.com
Pectolyase	Karlan,               Phonix, AZ, USA	8006	http://www.karlan.com
Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP)	Sigma	81420	http://www.sigmaaldrich.com
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma	A9418-5G	http://www.sigmaaldrich.com
Protamine sulphate	Sigma	P4380	http://www.sigmaaldrich.com
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920	http://www.sigmaaldrich.com
Xylene cyanol	Sigma	X4126	http://www.sigmaaldrich.com
Silicone vacuum grease heavy	Merck	107921	https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TS100/TS100F	http://www.nikoninstruments.com
Peristaltic pump	BIO-RAD	EP-1 Econo Pump	http://www.bio-rad.com
Grayscale digital camera	Scion Corporation	CFW-1308M	http://www.scioncorp.com
CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ	Carnegie Mellon		http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software
ImageJ	NIH		http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software
Econo Gradient Pump Fittings Kit	BIO-RAD	731-9006	http://www.bio-rad.com
Connectors, manifold	DirectMed		http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S
Burette infusion sets (columns)	Welford	IF-BR-001	http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61
Tubing	TYGON	R-3603	http://www.usplastic.com
Plexiglass slide etc.	Perspectiv		http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'.
3M packaging Scotch tape 1'', clear	Viking Industrial, UK	VKMONO25	http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK