Protocole SIVQ-LCM pour l'instrument ArcturusXT
Summary
SIVQ-LCM est une approche novatrice qui exploite un algorithme informatique, spatialement invariant quantification vectorielle (SIVQ), à conduire la microdissection par capture laser (LCM) de processus. Le flux de travail SIVQ-LCM améliore grandement la vitesse et la précision de microdissection, avec des applications à la fois dans la recherche et les milieux cliniques.
Abstract
SIVQ-LCM est une nouvelle méthodologie qui automatise et rationalise le processus de dissection laser dépend utilisateur plus traditionnel. Il vise à créer une plate-forme technologique de dissection laser de pointe, rapidement personnalisable. Dans ce rapport, nous décrivons l'intégration du logiciel d'analyse d'image spatialement invariant quantification vectorielle (SIVQ) sur l'instrument ArcturusXT. Le système contient à la fois un ArcturusXT infrarouge (IR) et ultraviolet (UV), laser, permettant une cellule particulière ou de grandes dissections de la région. Le but principal est d'améliorer la vitesse, la précision et la reproductibilité de la dissection laser pour augmenter le débit d'échantillons. Cette nouvelle approche facilite microdissection des deux tissus animaux et humains dans la recherche et la gestion des patients.
Introduction
Initialement développé dans le milieu des années 1990, microdissection laser (LCM) permet à l'utilisateur de capturer précisément des cellules spécifiques ou des régions cellulaires à partir d'une section de tissu histologique par visualisation microscopique 1, 2. De nombreuses études comparant l'analyse moléculaire de LCM contre les éraflures de tissus illustrent l'intérêt de la méthode 3-12. En outre, il ya trois publications de protocole vidéo sur la technologie qui sont disponibles pour l'affichage 13, 14. Cependant, en dépit de sa valeur éprouvée, LCM peut être fastidieuse et laborieuse lorsque la cible d'intérêt est une population de cellules dispersées dans une coupe de tissu hétérogène, ou quand un grand nombre de cellules sont nécessaires pour des applications spécifiques en aval telles que la protéomique. La charge qui pèse sur l'opérateur humain nous a conduit à développer une approche semi-automatique dissection pour LCM en combinant un algorithme d'analyse d'image puissant pour guider le processus de LCM 15.
<p class = "jove_content"> En collaboration avec l'Université du Michigan, notre laboratoire du NIH étendu précédemment développé et rapporté spatialement invariant quantification vectorielle (SIVQ) algorithme de manière à lui permettre de semi-automatiser le processus de sélection des tissus intrinsèque à guidée microdissection, rendant ainsi disponible un outil avec le pathologiste ou la vie scientifique à l'esprit. Spatialement invariant quantification vectorielle (SIVQ) est un algorithme qui permet à l'utilisateur de simplement "cliquer" sur une caractéristique histologique d'intérêt pour créer un vecteur d'anneau (de caractéristique d'image prédicat) qui peut être utilisé pour rechercher l'ensemble de l'image histologique, en ajustant le seuil statistique 16 à 21 selon les besoins. La carte de chaleur résultante affiche la qualité des matchs à la fonction initiale de l'image sous-jacente et est ensuite converti en une seule couleur (rouge) de la carte d'annotation qui peut être importé dans l'instrument de LCM. Le logiciel de sélection automatique, AutoScanXT, est ensuite utilisé pour dessiner une carte à base desur l'annotation de guidage SIVQ la capture de cellules cibles à partir de l'échantillon de tissu. Le protocole détaillé ci-dessous décrit la mise en œuvre de SIVQ dans le workflow de microdissection.Protocol
Representative Results
Discussion
Nous présentons un protocole pour l'application de SIVQ-LCM à microdissect cellules épithéliales immunocolorées de FFPE tissu mammaire humain. L'utilisation d'un algorithme d'analyse d'image, tel que SIVQ, réduit la quantité de mains sur le temps requis pour le processus de microdissection. Il s'agit d'un progrès potentiellement important pour le domaine de temps et d'efforts depuis l'opérateur est typiquement l'étape limitante pour la dissection précise des cellules d&…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L'étude a été financée en partie par le Programme de recherche intra-muros des Instituts nationaux de la santé, Institut national du cancer, Centre de recherche sur le cancer.
Materials
| Positive Charged Glass Slides | Thermo Scientific | 4951Plus-001 | |
| Xylenes, ACS reagent, ≥98.5% xylenes + ethylbenzene basis | Sigma Aldrich | 247642 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous | The Warner-Graham Company | 6.505E+12 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Arcturus CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| ArcturusXT Laser Microdissection Instrument | Life Technologies | ARCTURUSXT | |
| AutoScanXT Software | Life Technologies | An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM. | |
| Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ) | University of Michigan | This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu] |
Riferimenti
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Edwards, R. A. Laser capture microdissection of mammalian tissue. J Vis Exp. (8), (2007).
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett’s esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature. 1, 586-603 (2006).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).
- Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).
- Eberle, F. C., et al. Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC medical genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC medical genomics. 2, 13 (2009).
- Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine. PloS one. 8, e53711 (2013).
- Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. J Vis Exp. (74), (2013).
- Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. (39), (2010).
- Hipp, J., et al. SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling. Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).
- Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology. J Pathol Inform. 2, 13 (2011).
- Hipp, J., et al. Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm. Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).
- Hipp, J., et al. Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification. Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).
- Hipp, J., et al. Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ. Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).
- Cheng, J., et al. Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies. Journal of pathology. 2, 37 (2011).
- Roy Chowdhuri, S., et al. Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples. Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).
- Hipp, J., et al. Image Microarrays (IMA): Digital Pathology’s Missing Tool. Journal of pathology. 2, (2011).
- Hanson, J. C., et al. Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments. Nature. 6, 457-467 (2011).
