التعرف السريع على البكتيريا سالبة الجرام من ثقافة الدم في مرق عن طريق MALDI-TOF الطيف الكتلي
Summary
تطبيق مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين وقت الرحلة (MALDI-TOF) مطياف الكتلة (MS) مباشرة إلى ثقافة الدم مرق يعجل تحديد البكتيريا. طريقة عرض هو طريقة سريعة وموثوق بها لتحديد البكتيريا سالبة الجرام مباشرة من ثقافة الدم المرق.
Abstract
دورا هاما في مختبر علم الأحياء المجهرية السريرية هو توفير التعرف السريع على البكتيريا المسببة للعدوى مجرى الدم. تحديد التقليدية يتطلب ثقافة فرعية من مرق أشار ثقافة الدم مع تحديد متاحة إلا بعد المستعمرات على أجار الصلبة قد نضجت. MALDI-TOF MS هو، طريقة سريعة يمكن الاعتماد عليها لتحديد غالبية البكتيريا ذات الصلة سريريا عندما يطبق على المستعمرات على وسائل الاعلام الصلبة. تطبيق MALDI-TOF MS مباشرة إلى ثقافة الدم مرق هو نهج جذابة كما أن لديها القدرة على تسريع تحديد الأنواع من البكتيريا وتحسين التدبير العلاجي السريري. ومع ذلك، مشكلة هامة للتغلب هو إزالة ما قبل التحليل بالتدخل راتنجات والبروتينات والهيموغلوبين الواردة في عينات الدم التي الثقافة، إن لم يكن إزالتها، وتتداخل مع MS الأطياف ويمكن أن يؤدي إلى تحديد درجات التمييز غير كافية أو منخفضة. بالإضافة إلى أنه من الضروري التركيز bacterالجيش العراقي لتطوير أطياف نوعية كافية. يصف الطريقة المعروضة تركيز، وتنقية، واستخراج البكتيريا سالبة الجرام السماح للتشخيص المبكر من البكتيريا من مرق أشار ثقافة الدم.
Introduction
المرضى الذين يعانون من عدوى مجرى الدم (BSI) وذلك بسبب البكتيريا لا تزال لدينا عالية وفيات في المستشفى، وتتراوح 6-48٪ 1. تسليم المضادات الحيوية المناسبة المجرب يعزز البقاء على قيد الحياة وفي فرعية من المرضى الذين يعانون من التسمم الحاد، كل تأخير ساعة إلى العلاج المناسب يرتبط بقاء انخفضت 2،3. وفقا لذلك، هدفا رئيسيا من المختبر السريري للكشف بسرعة، وتحديد والتواصل وجود البكتيريا في الثقافات الدم لإبلاغ القرارات السريرية. وقد ثبت أن مختبر الميكروبيولوجيا ديها أكبر تأثير على العلاج المضادة للميكروبات في وقت الإبلاغ وصمة عار غرام 4 ومؤخرا، أظهرت دراسة وصفية ذلك الوقت الامتزاز بمساعدة الليزر مصفوفة / تأين مطياف الكتلة الطيران (TOF MALDI-MS) يقوم مباشرة على المرق ثقافة الدم تؤثر وصف في أكثر من ثلث BSI الناجم عن البكتيريا سالبة الجرام 5.
<p class="jove_content"> وقد أدى التطوير التجاري لMALDI-TOF MS إلى أداة فعالة المختبر لتحديد الكائنات الدقيقة 6،7. والآن راسخة التكنولوجيا وتم دمجها في العديد من المختبرات لتحديد سريعة ودقيقة من الكائنات الدقيقة المعزولة على 6،8 وسائل الاعلام الصلبة. التطبيق المباشر للMALDI-TOF MS لثقافة الدم (BC) مرق التي أشار "ايجابية" للكائنات الدقيقة تناشد كل من الأطباء ومديري المختبرات بسبب القدرة على الحصول على تحديد وقت سابق من الكائنات الحية الدقيقة بتكلفة منخفضة.وقد المنفعة السريرية من التطبيق المباشر للMALDI-TOF MS لثقافة الدم مرق محدودة بسبب مجموعة واسعة من الحساسيات وحظ بالمقارنة مع الأساليب ثقافة المظهرية قياسية استنادا لتحديد الهوية، مع تقارير عن تحديد ناجحة من البكتيريا سالبة الجرام تتراوح 47-98،9 9-11٪. الاختلاف في حساسية المرجحتتعلق تكوين BC مرق، تركيز البكتيريا الأولية، والتباين في أساليب إعداد العينات فضلا عن مجموعة من الكائنات الحية سلبية الغرام التي واجهتها في دراسة السكان 9. مقارنة مع هذه البروتوكولات الأخرى المنشورة على الطريقة المعروضة هنا يتجنب استخدام الإيثانول، كلوريد الأمونيوم أو إضافية (غير المصفوفة) أسيتونتريل. ونتيجة لبيليه البكتيرية سوف تبقى قابلة للحياة (حتى نقطة استخراج البروتين) السماح لطرق الاختبار المظهري التعرض المحتملة ليتم تطبيقها مباشرة إلى هذه الكائنات في المرق. بالإضافة إلى ذلك، فقد تبين طريقة عرض لتكون رخيصة وموثوقة وسريعة مع تحديد البكتيرية المتوفرة في غضون 25 دقيقة من ثقافة الدم غرام النتائج وصمة عار، مع الحد الأدنى 'على يد' الوقت 12.
هذه طريقة بسيطة بروتوكول تدور تحلل في المنزل باستخدام استخراج حمض الفورميك تطبيقها مباشرة على إيجابية مرق ثقافة الدم لتحديد غرام ب سلبيacteria مع التكنولوجيا MALDI-TOF MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
من المهم عند تطبيق MALDI-TOF MS للثقافة مرق الدم الذي يتم تنفيذ الخطوات آخر الطرد المركزي مع الرعاية الكافية لا في التعديل مكونات فصلها. من المهم بصفة خاصة لإزالة مكونات ثقافة الدم والبروتينات الخلوية الإنسان، بما في ذلك الهيموغلوبين، والتي قد تنتج طفرات التدخل مع أطياف M…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| BACTEC Plus Aerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442192 | |
| BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442265 | |
| BACTEC Peds Plus Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442194 | |
| Vacutainer – Blood transfer device | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 364880 | Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury |
| Vacutainer SST 5.0mL, Advance plus | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 367954 | Serum separating tube |
| Syringe 10 mL | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 302143 | |
| Transfer pipette | Samco, USA | 222-20S | |
| Transfer pipette (fine tipped) | Samco, USA | 232-20S | |
| Microcentrifuge tube (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030.120.094 | |
| Sterile water (DNAse and RNAse free) | Life Technologies, Carlsbad, California, USA | 10977-015 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | F0507 | |
| Matrix solution | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 285074 | 10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid |
| Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS | Bruker Daltonics, Bremen Germany | Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software |
Riferimenti
- Bearman, G. M., Wenzel, R. P. Bacteremias: a leading cause of death. Arch. Med. Res. 36 (6), 646-659 (2005).
- Leibovici, L., Shraga, I., Drucker, M., Konigsberger, H., Samra, Z., Pitlik, S. D. The benefit of appropriate empirical antibiotic treatment in patients with bloodstream infection. J. Intern. Med. 244 (5), 379-386 (1998).
- Kumar, A., et al. Duration of hypotension before initiation of effective antimicrobial therapy is the critical determinant of survival in human septic shock. Crit. Care Med. 34 (6), 1589-1596 (2006).
- Munson, E. L., Diekema, D. J., Beekmann, S. E., Chapin, K. C., Doern, G. V. Detection and treatment of bloodstream infection: laboratory reporting and antimicrobial management. J. Clin. Microbiol. 41 (1), 495-497 (2003).
- Clerc, O., Prod’hom, G., Vogne, C., Bizzini, A., Calandra, T., Greub, G. Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry on the Clinical Management of Patients With Gram-negative Bacteremia: A Prospective Observational Study. Clin. Infect. Dis. 56 (8), 1101-1107 (2013).
- Dekker, J. P., Branda, J. A. . MALDI-TOF Mass Spectrometry in the Clinical Microbiology Laboratory. Clinical Microbiology Newslette. 33 (12), 87-93 (2011).
- Seng, P., et al. Ongoing revolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin. Infect. Dis. 49 (4), 543-551 (2009).
- Neville, S. A., et al. Utility of matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight mass spectrometry following introduction for routine laboratory bacterial identification. J. Clin. Microbiol. 49 (8), 2980-2984 (2011).
- Schmidt, V., Jarosch, A., März, P., Sander, C., Vacata, V., Kalka-Moll, W. Rapid identification of bacteria in positive blood culture by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (3), 311-317 (2012).
- March-Rosselló, G. A., Muñoz-Moreno, M. F., de Urriés, M. C., Bratos-Pérez, M. A. A differential centrifugation protocol and validation criterion for enhancing mass spectrometry (MALDI-TOF) results in microbial identification using blood culture growth bottles. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 32 (5), 699-704 (2012).
- Christner, M., Rohde, H., Wolters, M., Sobottka, I., Wegscheider, K., Aepfelbacher, M. Rapid identification of bacteria from positive blood culture bottles by use of matrix-assisted laser desorption-ionization time of flight mass spectrometry fingerprinting. J. Clin. Microbiol. 48 (5), 1584-1591 (2010).
- Gray, T. J., Thomas, L., Olma, T., Iredell, J. R., Chen, S. C. Rapid identification of Gram-negative organisms from blood culture bottles using a modified extraction method and MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 72 (2), 110-112 (2013).
- Hazelton, B. J., Thomas, L. C., Unver, T., Iredell, J. R. Rapid identification of Gram-positive pathogens and their resistance genes from positive blood culture broth using a multiplex tandem RT-PCR assay. J. Med. Microbiol. 62 (2), 223-2231 (2013).
- Saffert, R. T., Cunningham, S. A., Mandrekar, J., Patel, R. Comparison of three preparatory methods for detection of bacteremia by MALDI-TOF mass spectrometry. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 73 (1), 21-26 (2012).
- Consoir, C., Lörch, D., Schneider, C. Direct identification of bacteria from charcoal-containing blood culture bottles using matrix-assisted laser desorption/ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (10), 2843-2850 (2012).
- Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O. Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper™ kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (9), 2269-2281 (2012).
- Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).
- Novel, , et al. improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).
- Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database. J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).
