Identification rapide des bactéries à Gram négatif de sang Bouillon de culture à l'aide MALDI-TOF spectrométrie de masse

Summary

L'application de laser désorption / ionisation de temps assistée par matrice de vol (MALDI-TOF), la spectrométrie de masse (MS) directement à un bouillon de culture de sang accélère l'identification de bactéries. La méthode présentée est une méthode rapide et fiable pour l'identification des bactéries à Gram négatif directement à partir de bouillon de culture de sang.

Abstract

Un rôle important du laboratoire de microbiologie clinique est de fournir une identification rapide de bactéries causant l'infection sanguine. Identification traditionnelle nécessite la sous-culture de signalé bouillon de culture de sang avec identification disponible uniquement après que les colonies sur gélose solide ont mûri. MALDI-TOF MS est une méthode fiable pour l'identification rapide de la majorité des bactéries cliniquement pertinentes lorsqu'il est appliqué à des colonies sur un milieu solide. L'application de MALDI-TOF MS directement bouillon de culture de sang est une approche intéressante car elle a le potentiel d'accélérer l'identification des espèces de bactéries et d'améliorer la gestion clinique. Cependant, un problème important à surmonter est la pré-analyse suppression de brouilleurs résines, des protéines et de l'hémoglobine contenue dans le sang culture spécimens qui, s'il n'est pas retiré, interfèrent avec les spectres MS et peuvent entraîner des scores d'identification discrimination insuffisantes ou faibles. En outre, il est nécessaire de concentrer bacteria pour développer les spectres d'une qualité suffisante. La méthode présentée décrit la concentration, la purification et l'extraction des bactéries Gram négatives permettant l'identification précoce des bactéries à partir d'un bouillon de culture de sang signalé.

Introduction

Les patients atteints d'une infection sanguine (BSI) en raison de bactéries continuent d'avoir une forte mortalité à l'hôpital, allant de 6 à 48% ^1. La livraison de l'antibiotique empirique approprié favorise la survie et dans le sous-ensemble de patients atteints de sepsis sévère, chaque heure de retard à un traitement approprié est corrélée à une diminution de la survie ^{de 2,3.} En conséquence, un objectif clé du laboratoire clinique est de détecter rapidement, identifier et communiquer la présence de bactéries dans les cultures de sang pour éclairer les décisions cliniques. Il a été démontré que le laboratoire de microbiologie a la plus grande influence sur la thérapie antimicrobienne au moment de la notification de la coloration de Gram ⁴ et récemment, une étude d'observation a démontré que le temps de désorption laser assistée par matrice / ionisation de spectrométrie de masse de vol (MALDI-TOF MS) réalisée directement sur ​​des bouillons de culture de sang influencer la prescription dans plus d'un tiers de BSI causée par des bactéries Gram négatif ^5.

<p class="Jove_content"> Le développement commercial de MALDI-TOF MS a conduit à un outil de laboratoire efficace pour l'identification des micro-organismes ^6,7. La technologie est maintenant bien établie et a été intégrée dans de nombreux laboratoires pour l'identification rapide et précise des micro-organismes isolés sur solide ^6,8 médiatique. L'application directe de MALDI-TOF MS à la culture de sang (BC) de bouillon qui ont signalé «positif» pour les micro-organismes recours à des cliniciens et des gestionnaires de laboratoire en raison de la possibilité d'obtenir une identification plus rapide des micro-organismes à faible coût.

L'utilité clinique de l'application directe de MALDI-TOF MS de bouillon de culture de sang a été limitée par le large éventail de sensibilités observées par rapport aux méthodes basées sur la culture de phénotypique norme d'identification, avec les rapports de l'identification réussie des bactéries Gram négatives allant de 47 à 98,9 ^9-11%. La variation de la sensibilité probableconcerne la composition BC bouillon, la concentration bactérienne initiale, la variation dans les méthodes de préparation des échantillons ainsi que le réseau des organismes Gram négatif rencontrées dans les populations d'étude ^9. Par rapport à ces autres protocoles publiés la méthode présentée ici permet d'éviter l'utilisation de l'éthanol, le chlorure d'ammonium ou supplémentaire (non-matrice) acétonitrile. Par conséquent, le culot bactérien demeure viable (jusqu'à ce que le point d'extraction de la protéine) permettant méthodes potentielles de test phénotypique de susceptibilité à être appliqués directement sur ces micro-organismes dans le bouillon. En outre, la méthode présentée a été montré pour être peu coûteux, fiable et rapide de l'identification bactérienne disponible dans 25 min de la culture de sang Gram résultats de la coloration, avec un minimum de «pratique» du temps ^12.

Cette méthode est un protocole simple en interne spin-lyse en utilisant l'extraction de l'acide formique est appliqué directement sur des bouillons de culture de sang positifs pour identifier Gram négatif bacteria avec la technologie MALDI-TOF MS.

Protocol

1. Hémoculture bouillons Signaler comme «Positive» Retirez la bouteille d'hémoculture signalé du cabinet continue d'incubation de surveillance et le placer dans une enceinte de sécurité biologique. Remarque: Les bouteilles peuvent contenir des micro-organismes dangereux et les précautions universelles doivent être suivies. En raison du risque d'aérosols infectieux dans l'échantillonnage, toutes les procédures d'échantillonnage doivent être effectuées dans une hotte à …

Representative Results

Le MS spectres MALDI-TOF généré sont comparés à la base de données de référence intégrée des spectres. Un score logarithmique est attribué pour la confiance du match entre l'isolat de test et la base de données de référence isolats, avec la recommandation d'un score ≥ 1,7 nécessaires à l'identification probable au niveau de la génération (figure 1) et ≥ 2,0 pour une identification probable des espèces (Figure 2). Rapport au niveau de l'espèce lors…

Discussion

Il est important lors de l'application MALDI-TOF MS de bouillon de culture de sang que les étapes de post de centrifugation sont effectuées avec suffisamment de soin à ne pas remixer les composants séparés. Il est particulièrement important de supprimer les constituants de culture de sang et de protéines cellulaires humaines, y compris l'hémoglobine, qui peuvent produire des pointes interférant avec les spectres MALDI-TOF.

Bien que MS fabrique recommander couper du score de …

Materials

BACTEC Plus Aerobic/F Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442192
BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442265
BACTEC Peds Plus Medium	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	442194
Vacutainer – Blood transfer device	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	364880	Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury
Vacutainer SST 5.0mL, Advance plus	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	367954	Serum separating tube
Syringe 10 mL	Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA	302143
Transfer pipette	Samco, USA	222-20S
Transfer pipette (fine tipped)	Samco, USA	232-20S
Microcentrifuge tube (2.0 mL)	Eppendorf, Hamburg, Germany	0030.120.094
Sterile water (DNAse and RNAse free)	Life Technologies, Carlsbad, California, USA	10977-015
Formic acid	Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA	F0507
Matrix solution	Bruker Daltonics, Bremen Germany	285074	10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid
Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS	Bruker Daltonics, Bremen Germany		Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software