Rapida identificazione dei batteri Gram-negativi dal sangue brodo di coltura Uso MALDI-TOF
Summary
L'applicazione di desorbimento laser assistita da matrice tempo / ionizzazione di volo (MALDI-TOF) spettrometria di massa (MS) direttamente emocoltura brodo velocizza l'identificazione dei batteri. Il metodo proposto è un metodo rapido e affidabile per l'identificazione dei batteri Gram negativi direttamente dalla cultura sangue brodo.
Abstract
Un ruolo importante del laboratorio di microbiologia clinica è quello di fornire una rapida identificazione dei batteri che causano infezioni flusso sanguigno. L'identificazione tradizionale richiede la sub-cultura del segnalato brodo di coltura di sangue con l'identificazione disponibili solo dopo colonie su agar solido hanno maturato. MALDI-TOF MS è un metodo rapido affidabile per l'identificazione della maggioranza dei batteri clinicamente rilevanti quando applicato colonie su supporti solidi. L'applicazione di MALDI-TOF MS direttamente alla cultura del sangue brodo è un approccio interessante in quanto ha il potenziale di accelerare l'identificazione delle specie di batteri e migliorare la gestione clinica. Tuttavia, un problema importante da superare è la rimozione pre-analisi di interferenti resine, proteine e di emoglobina contenute nei campioni di sangue di cultura che, se non rimosso, interferiscono con la MS spettri e può portare a punteggi di identificazione discriminazione insufficienti o bassi. Inoltre è necessario concentrare Bacteria per sviluppare spettri di qualità sufficiente. Il metodo presentato descrive la concentrazione, la purificazione e l'estrazione dei batteri Gram-negativi che consentano l'identificazione precoce dei batteri da un segnalata cultura sangue brodo.
Introduction
I pazienti con infezione sangue (BSI) a causa di batteri continuano ad avere alta mortalità in ospedale, che vanno 6-48% 1. La consegna di un adeguato antibiotica empirica promuove la sopravvivenza e nel sottogruppo di pazienti con sepsi grave, ogni ora di ritardo alla terapia appropriata è correlato alla diminuzione della sopravvivenza 2,3. Di conseguenza, un obiettivo chiave del laboratorio clinico è quello di rilevare rapidamente, identificare e comunicare la presenza di batteri nelle colture di sangue per informare le decisioni cliniche. È stato dimostrato che il laboratorio microbiologia ha la più grande influenza sulla terapia antimicrobica al momento di segnalare la colorazione di Gram 4 e recentemente, uno studio d'osservazione ha dimostrato che il tempo desorbimento laser assistita dalla matrice / ionizzazione di volo spettrometria di massa (MALDI-TOF MS) eseguita direttamente sul brodi di coltura di sangue influenzare la prescrizione in oltre un terzo di BSI causate da batteri Gram-negativi 5.
<p class="Jove_content"> Lo sviluppo commerciale di MALDI-TOF MS ha portato ad uno strumento efficace laboratorio per l'identificazione di microrganismi 6,7. La tecnologia è ormai ben consolidata ed è stato integrato in molti laboratori per l'identificazione rapida e accurata dei microrganismi isolati su supporti 6,8 solida. L'applicazione diretta di MALDI-TOF MS alla cultura del sangue (BC) brodo che hanno segnalato "positivo" per i microrganismi appello a entrambi i medici e responsabili di laboratorio a causa della possibilità di ottenere la tempestiva individuazione dei microrganismi a basso costo.L'utilità clinica di applicazione diretta di MALDI-TOF MS alla cultura del sangue brodo è stato limitato dalla vasta gamma di sensibilità osservati rispetto ai metodi di coltura fenotipica standard di base di identificazione, con i rapporti di identificazione successo dei batteri Gram-negativi che vanno 47-98,9 9-11%. La variazione di sensibilità probabilesi riferisce alla composizione aC brodo, concentrazione batterica iniziale, variazione nei metodi di preparazione del campione e la gamma di microrganismi Gram-negativi riscontrati in popolazioni di studio 9. Rispetto a questi altri protocolli pubblicati il metodo qui presentato evita l'uso di etanolo, cloruro di ammonio o aggiuntivo (non a matrice) acetonitrile. Come risultato il pellet batterico rimanere vitali (fino al punto di estrazione delle proteine) consentendo potenziali metodi di prova sensibilità fenotipica da applicare direttamente a questi organismi in brodo. Inoltre, il metodo presentato ha dimostrato di essere poco costoso, affidabile e rapido con identificazione batterica disponibile entro 25 min delle emocolture Gram risultati della colorazione, con minime 'mani' tempo 12.
Questo metodo è un semplice protocollo spin-lisi in casa utilizzando estrazione acido formico applicato direttamente positivi brodi di coltura sangue per identificare Gram negativi bacteria con la tecnologia MALDI-TOF MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
E 'importante quando si applica MALDI-TOF MS alla cultura del sangue brodo che le operazioni di post centrifugazione vengono eseguite con sufficiente attenzione a non rimescolare i componenti separati. È particolarmente importante rimuovere i componenti di coltura sangue e proteine cellulari umani, compresi emoglobina, che possono produrre picchi interferenti con gli spettri MALDI-TOF.
Anche se MS produce consiglia di tagliare punteggio ≥ 2.0 per le specie e ≥ 1.7 per l'id…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| BACTEC Plus Aerobic/F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442192 | |
| BACTEC Lytic/10 Anaerobic /F Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442265 | |
| BACTEC Peds Plus Medium | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 442194 | |
| Vacutainer – Blood transfer device | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 364880 | Single use sampling device reducing the risk of needlestick injury |
| Vacutainer SST 5.0mL, Advance plus | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 367954 | Serum separating tube |
| Syringe 10 mL | Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA | 302143 | |
| Transfer pipette | Samco, USA | 222-20S | |
| Transfer pipette (fine tipped) | Samco, USA | 232-20S | |
| Microcentrifuge tube (2.0 mL) | Eppendorf, Hamburg, Germany | 0030.120.094 | |
| Sterile water (DNAse and RNAse free) | Life Technologies, Carlsbad, California, USA | 10977-015 | |
| Formic acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USA | F0507 | |
| Matrix solution | Bruker Daltonics, Bremen Germany | 285074 | 10 mg/ml α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, 50% acetonitrile, 2.5% trifluoroacetic acid |
| Benchtop microflex LT MALDI-TOF MS | Bruker Daltonics, Bremen Germany | Utilizing BioTyper 3.1 (Build 65) and FlexControl 3.3 (Build 99) software |
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