Analisi del danno epiteliale Prodotto da<em> Entamoeba histolytica</em> Infezione

Summary

L'infezione umana da Entamoeba histolytica porta ad amebiasi, una delle principali cause di diarrea nei paesi tropicali. L'infezione è avviata da patogeno con cellule epiteliali intestinali, provocando l'apertura dei contatti cellula-cellula e di conseguenza diarrea, a volte seguita da infezione fegato. Questo articolo fornisce un modello per valutare le interazioni primi ospite-patogeno per migliorare la nostra comprensione della patogenesi amebiasi.

Abstract

Entamoeba histolytica è l'agente eziologico di amebiasi umana, una delle principali cause di diarrea e di ascesso epatico nei paesi tropicali. L'infezione è avviata da interazione del patogeno con le cellule epiteliali intestinali. Questa interazione porta alla rottura delle strutture intercellulari come giunzioni strette (TJ). TJ assicurare la chiusura dello strato epiteliale per separare tessuto ospite dal lume intestinale. Recenti studi forniscono prove che la rottura del TJ dalla proteina EhCPADH112 parassita è un prerequisito per E. invasione histolytica che è accompagnato da disfunzione della barriera epiteliale. Pertanto, l'analisi dei meccanismi molecolari coinvolti nella TJ smontaggio durante E. histolytica invasione è di fondamentale importanza per migliorare la nostra comprensione della patogenesi amebiasi. Questo articolo presenta un modello semplice che consente la valutazione delle interazioni iniziali ospite-patogeno e il potenziale parassita invasione. I parametri da analizzare sono transepithelial resistenza elettrica, l'interazione di EhCPADH112 con i recettori di superficie epiteliali, cambiamenti di espressione e la localizzazione di marcatori giunzionale epiteliali e la localizzazione delle molecole del parassita all'interno delle cellule epiteliali.

Introduction

Entamoeba histolytica è un singolo protozoo responsabile della amebiasi umana, un'infezione intestinale delle cellule causando infiammazione e diarrea. E. histolytica infetta fino a 50 milioni di persone ogni anno, ma solo circa il 10% delle persone infette sviluppano i sintomi associati a amebiasi ^1. L'infezione avviene per ingestione di alimenti contaminati o acqua contenente E. cisti histolytica. Nell'intestino, cisti producono trofozoiti vivi che aderiscono al colon mucina e proliferano ^2. Trofozoiti di solito si formano le cisti che vengono escreti con feci. In altri casi e per ragioni ancora sconosciute, trofozoiti rompere lo strato epiteliale intestinale e invadono i tessuti sottostanti. Nel peggiore dei casi, entrano nel flusso sanguigno e colpiscono altri organi come il fegato ^3.

Rompere la barriera epiteliale richiede interruzione di strutture transmembranal epiteliali che mantengono le cellule unite. Cellule epitelialicontatti sono formati dal complesso giunzionale apicale costituito stretto (TJ) e adherens giunzioni (AJ), e desmosomi ^4. Le giunzioni più apicali sono TJ, e quindi, sono la prima barriera offeso da E. histolytica e di alcuni altri agenti patogeni durante l'invasione host. TJ sono costituiti da recettori di adesione transmembranal come claudine, occludina e molecole di adesione giunzionale (JAM), che si impegnano in interazioni eterofili omo-o con i recettori della cellula vicina. Sono intracellulare vincolati da molecole impalcatura delle occludere zonula (SO) della famiglia che collegano recettori di adesione al citoscheletro di actina per fornire ulteriore resistenza meccanica all'epitelio. TJ sono responsabili per sigillare tessuto intestinale dal lume intestinale, impedendo all'acqua eccessiva e perdita soluto. Così, dopo TJ sono interrotti dal parassita, i tessuti sono invase. E. histolytica secerne diverse molecole quali: (i) quelli coinvolti nella adesione di amebe a targcellule et ^5; (Ii) fattori membrana attiva partecipano uccisione delle cellule ospiti per esocitosi, per esempio, i peptidi che formano canali ionici chiamati amoebapores ^6,7; e (iii) proteinasi che degradano le proteine ​​della matrice extracellulare e mediano tessuto disintegrazione ^5,8,9.

La cisteina proteasi EhCP112 e la molecola di adesione EhADH112 che insieme formano il complesso EhCPADH112 sono due E. histolytica virulenza proteine ​​che svolgono un ruolo importante nello smontaggio di TJ ^10. Trofozoiti vivi, loro lisati totali e prodotti secreti inducono cambiamenti molecolari nel TJ complesso e funzionale disturbo della barriera epiteliale. In questo studio, è dimostrato che EhCP112 e EhADH112 interagiscono con occludina e claudin-1 proteine ​​che portano alla internalizzazione e la degradazione delle proteine ​​cellulari, facilitando così E. ingresso histolytica attraverso la via paracellulare.

I nostri dati e quelli of altri gruppi di ^11-17 suggeriscono con forza la necessità di interazioni ospite-patogeno specifiche che consentono parassita invasione. Svelare le basi molecolari di queste interazioni è della massima importanza per una migliore comprensione della patogenesi amebiasi. Disturbo selettivo di TJ da trofozoiti, caratterizzate da un aumento della permeabilità paracellulare, può essere misurata da una diminuzione della resistenza elettrica transepiteliale (TER). Il trasferimento delle proteine ​​parassite verso epiteli ospitanti può essere determinato da immunofluorescenza e microscopia confocale, un metodo che può anche rivelare co-localizzazione di fattori di virulenza amebe con marcatori epiteliali giunzionale indicano possibili interazioni dirette. In questo articolo, descriviamo in dettaglio come le cellule epiteliali e trofozoiti sono coltivati, raccolti e manipolati per esaminare le interazioni ospite-patogeno e le loro conseguenze.

Protocol

1. Creazione e mantenimento di E. Culture histolytica Crescere in condizioni asettiche (completamente libero di tutti gli altri organismi contaminanti) 1 x 10 5 trofozoiti di Entamoeba histolytica ceppo HML: IMSS clonare un 18 a 16 x 125 mm tubi di coltura con teflon tappi a vite marittimo di linea (o 1 x 10 6 trofozoiti in un usa e getta T- 25 beuta) e 15 ml (o 50 ml in T-25 pallone) di TYI-S-33 medio (TYI brodo supplementato con 3% Diamante vitamin…

Representative Results

Per un E. successo cultura histolytica, due importanti condizioni devono essere soddisfatte: la crescita in condizioni axeniche e raccolto in fase logaritmica. In precedenza, colture di E. histolytica erano facilmente stabilita in associazione con alcune specie di batteri o trypanosomatids 22. Tuttavia, al giorno d'oggi è comune avere la coltivazione axenic di questo parassita che significa un subcoltivazione indefinito di amebe in un ambiente privo di batteri che metabolizzano…

Discussion

Per studiare in vitro le interazioni ospite-patogeno di corso di infezione da E. epiteliale histolytica, è fondamentale lavorare con le culture consolidate di entrambe le cellule epiteliali e trofozoiti. Ad esempio, in passato, E. culture histolytica erano stati di solito stabiliti in associazione con alcune specie di batteri o trypanosomatids ^22,23. Tuttavia, co-coltivazione di E. culture histolytica è controproducente per lo studio de…

Materials

Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A	IMSS Hospital, Mexico	Without/number	Virulent trophozoites18
TYI broth	Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine  0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
				Bovine serum adult	Microlab , Labs., Mex.	SU146	Use at 10% and inactivated to 56° C for 30 min
				Diamond  vitamin  mixture- Tween 80	In vitro	SR-07	Use at 3%
				Penicillin	Lakeside,  Méx.	34564SSA IV	0.5 IU/mL
				Streptomycin	Lakeside,  Méx.	75757SSA IV	35 µg/ mL
				Pyrex 15 mL screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps	Corning-Pyrex	9826-16X	16×125 mm, capacity 15 mL and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
				Cell culture plates, 6 Well	Corning-Costar	3516	Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
				25cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430168	Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I	American Type Culture Collection	CCL34	Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium	Gibco	12800-017	Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum	In vitro	S-02	Use at 10%.
Penicillin/Streptomycin mixture	In vitro	A-01	Stock solution 10,000 U/µg/mL
Insulin	AMSA	398MJ94SSA IV	Stock solution 100 IU/mL
Trypsin solution	In vitro	EN-005	0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430720	Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports	Corning-Costar	3470	0.4. µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24 well plate, growth area 0.3 cm2
24 well cell culture dish	Corning-Costar	3524	Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini	Roche	11836 153 001	Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/mL
pαZO-1	Invitrogen	402200	IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112	Homemade antibody	Without/ Number	IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM	Zymed	62-6811	Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zymed	816114	Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode	World Precision Instrument	102711	Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter	World Precision Instrument	12111	Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber	MEARIENFELD	610610	Hemocytometer
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Without/number	Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting medium for fluorescence
4´, 6-diamino-2-phenylindole (Dapi)	SIGMA	D-9542	0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A-1310	0.5%  final concentration for blocking solution