Analyse av epitelisk skade produsert av<em> Entamoeba histolytica</em> Infeksjon

Summary

Menneske-smitte av Entamoeba histolytica fører til amoebiasis, en viktig årsak til diaré i tropiske land. Infeksjon er initiert av patogen interaksjoner med intestinale epitelceller, provoserte åpningen av celle-celle-kontakter og følgelig diaré, noen ganger fulgt av leverinfeksjon. Denne artikkelen gir en modell for å vurdere tidlig host-patogen interaksjoner å forbedre vår forståelse av amoebiasis patogenesen.

Abstract

Entamoeba histolytica er den utløsende agent for menneskelig amoebiasis, en viktig årsak til diaré og lever abscess i tropiske land. Infeksjon er initiert av interaksjon av organismen med intestinale epitelceller. Dette samspillet fører til forstyrrelse av intercellulær strukturer som trange veikryss (TJ). TJ sikre tetning av epitellaget å skille vertsvevet fra tarmlumen. Nyere studier gir bevis for at forstyrrelse av TJ av den parasittiske protein EhCPADH112 er en forutsetning for E. histolytica invasjon som er ledsaget av epiteliale barriere dysfunksjon. Således analyse av molekylære mekanismer som er involvert i TJ demontering under E. histolytica invasjonen er av avgjørende betydning for å forbedre vår forståelse av amoebiasis patogenesen. Denne artikkelen presenterer en enkel modell som gjør at vurderingen av innledende vert-patogen interaksjoner og parasitten invasjonen potensial. Parametere som skal analyseres er transepithelial elektrisk motstand, samspill av EhCPADH112 med epiteliale overflate reseptorer, endringer i uttrykk og lokalisering av epitel junctional markører og lokalisering av parasitt molekyler i epitelceller.

Introduction

Entamoeba histolytica er en enkelt celle protozo ansvarlig for menneskelig amoebiasis, en tarminfeksjon forårsaker betennelse og diaré. E. histolytica infiserer opptil 50 millioner mennesker årlig, men bare ca 10% av infiserte mennesker utvikler symptomer assosiert til amoebiasis ^en. Smitte skjer ved inntak av forurenset mat eller vann som inneholder E. histolytica cyster. I tarmen, cyster produsere levende trophozoites som holder seg til kolon mucin og sprer ^to. Trophozoites vanligvis danne cyster som skilles ut via avføring. I andre tilfeller og for ennå ukjente årsaker, trophozoites bryte tarmepitel lag og invadere underliggende vev. I verste fall går de inn i blodstrømmen og påvirke andre organer som lever ^tre.

Breaking epiteliale barriere krever avbrudd av epitel transmembranal strukturer som opprettholder celler sluttet. Epitelcellekontakter er dannet av den apikale junctional kompleks bestående av stramt (TJ) og adherens veikryss (AJ), og desmosomes ^fire. De mest apikale veikryss er TJ, og derfor er de den første barrieren krenket av E. histolytica og noen andre patogener under verts invasjon. TJ består av transmembranal adhesjonsreseptorer som Claudins, occludin og junctional adhesjonsmolekyler (JAM) som driver homo-eller heterofile interaksjoner med reseptorer på nabocellen. De er intracellulært bundet av stillas molekyler av zonula okkludens (ZO) familie som kobler adhesjonsreseptorer til aktin cytoskjelettet for å gi ytterligere mekanisk styrke til Epitel. TJ er ansvarlig for tetting intestinal vev fra tarmen lumen, hindre overdreven vann og oppløst stoff lekkasje. Dermed, etter TJ blir forstyrret av parasitten, er vev invadert. E. histolytica utskiller flere molekyler som: (i) de som er involvert i adhesjon av amøber til TargET celler ^5; (Ii) Membranaktive faktorer som deltar i dreping av vertsceller ved exocytose, f.eks ionekanal-dannende peptider betegnet amoebapores ^6,7; og (iii) proteinases som forringer ekstracellulære matrix proteiner og megle vev oppløsning ^5,8,9.

Cystein protease EhCP112 og adhesjonsmolekylet EhADH112 som sammen danner EhCPADH112 komplekset er to E. histolytica virulens proteiner som spiller en viktig rolle i demontering av TJ ^10. Aktive trophozoites, deres totale lysates og skilles produkter indusere molekylære endringer i TJ komplekse og funksjonell forstyrrelse av epiteliale barriere. I denne studien er det vist at EhCP112 og EhADH112 samhandle med occludin og claudin-en proteiner fører til internalisering og nedbrytning av celleproteiner, og dermed tilrettelegge for E. histolytica inngang gjennom paracellular veien.

Våre data og de of andre grupper ^11-17 sterkt at nødvendigheten av spesifikke vert-patogen interaksjoner som lar parasitt invasjon. Rakne den molekylære basis av disse interaksjonene er av største betydning for en bedre forståelse av amoebiasis patogenesen. Selektiv forstyrrelse av TJ etter trophozoites, preget av økt paracellular permeabilitet, kan måles ved en nedgang i transepithelial elektrisk motstand (TER). Denne overføring av parasittiske proteiner mot verts epitel kan bli bestemt ved immunfluorescens farging og laser konfokal mikroskopi, en metode som også viser ko-lokalisering av amoeba virulensfaktorer med epitel-junksjonale markører som indikerer mulige direkte interaksjoner. I denne artikkelen beskriver vi i detalj hvordan epitelceller og trophozoites er dyrket, høstet og manipulert til å undersøke vert-patogen interaksjoner og deres konsekvenser.

Protocol

En. Etablering og vedlikehold av E. histolytica Kulturer Grow axenically (helt fri for alle andre forurensende organismer) 1 x 10 5 trophozoites av Entamoeba histolytica belastning HML: IMSS klone en 18 i 16 x 125 mm kultur rør med Teflon liner skrulokk (eller 1 x 10 6 trophozoites i en disponibel T- 25 kolbe) og 15 ml (eller 50 ml i T-25 kolbe) i Tyi-S-33 medium (Tyi buljong supplert med 3% Diamond vitamin-blanding, 10% varme-inaktivert voksen bovin serum, …

Representative Results

For en vellykket E. histolytica kultur, må to viktige forutsetninger være oppfylt: vekst i axenic forhold og innhøsting i logaritmisk fase. Tidligere kulturer av E. histolytica lett ble etablert i forbindelse med visse arter av bakterier eller trypanosomatids 22. Men i dag er det vanlig å ha axenic dyrking av denne parasitten betyr ubestemt subcultivation av amøber i et miljø fritt for metabolizing bakterier, sopp, protozoer, eller metazoan celler. I tillegg høste trophozoites under s…

Discussion

For å studere i vitro vert-patogen interaksjoner under epithelial infeksjon etter E. histolytica, er det avgjørende å jobbe med godt etablerte kulturer av både epitelceller og trophozoites. For eksempel, tidligere, E. histolytica kulturer hadde vanligvis er etablert i forbindelse med visse arter av bakterier eller trypanosomatids ^22,23. Men co-dyrking av E. histolytica kulturer er kontraproduktivt for studiet av host-patogen interaksjoner fordi observerte virkninger på…

Materials

Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A	IMSS Hospital, Mexico	Without/number	Virulent trophozoites18
TYI broth	Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine  0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
				Bovine serum adult	Microlab , Labs., Mex.	SU146	Use at 10% and inactivated to 56° C for 30 min
				Diamond  vitamin  mixture- Tween 80	In vitro	SR-07	Use at 3%
				Penicillin	Lakeside,  Méx.	34564SSA IV	0.5 IU/mL
				Streptomycin	Lakeside,  Méx.	75757SSA IV	35 µg/ mL
				Pyrex 15 mL screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps	Corning-Pyrex	9826-16X	16×125 mm, capacity 15 mL and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
				Cell culture plates, 6 Well	Corning-Costar	3516	Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
				25cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430168	Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I	American Type Culture Collection	CCL34	Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium	Gibco	12800-017	Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum	In vitro	S-02	Use at 10%.
Penicillin/Streptomycin mixture	In vitro	A-01	Stock solution 10,000 U/µg/mL
Insulin	AMSA	398MJ94SSA IV	Stock solution 100 IU/mL
Trypsin solution	In vitro	EN-005	0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430720	Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports	Corning-Costar	3470	0.4. µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24 well plate, growth area 0.3 cm2
24 well cell culture dish	Corning-Costar	3524	Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini	Roche	11836 153 001	Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/mL
pαZO-1	Invitrogen	402200	IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112	Homemade antibody	Without/ Number	IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM	Zymed	62-6811	Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zymed	816114	Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode	World Precision Instrument	102711	Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter	World Precision Instrument	12111	Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber	MEARIENFELD	610610	Hemocytometer
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Without/number	Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting medium for fluorescence
4´, 6-diamino-2-phenylindole (Dapi)	SIGMA	D-9542	0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A-1310	0.5%  final concentration for blocking solution