La fiabilidad de los resultados en experimentos metabolómica depende de la eficacia y reproducibilidad de la preparación de la muestra. Se describe un método riguroso y en profundidad que permite la extracción de metabolitos a partir de fluidos biológicos con la opción de analizar posteriormente hasta miles de compuestos, o sólo las clases de compuestos de interés.
La metabolómica es un campo emergente que permite perfiles de muestras de organismos vivos con el fin de obtener información sobre los procesos biológicos. Un aspecto vital de la metabolómica es la preparación de muestras mediante el cual las técnicas inconsistentes generan resultados poco fiables. Esta técnica abarca la precipitación de proteínas, extracción líquido-líquido, y extracción en fase sólida como un medio de fraccionamiento de metabolitos en cuatro clases distintas. Se obtiene Mejora enriquecimiento de moléculas de baja abundancia con un incremento resultante de la sensibilidad, y en última instancia se traduce en la identificación de moléculas con más confianza. Esta técnica se ha aplicado a plasma, fluido de lavado broncoalveolar, y muestras de líquido cefalorraquídeo con volúmenes tan bajas como 50 l. Las muestras se pueden utilizar para múltiples aplicaciones posteriores; Por ejemplo, el sedimento resultante de la precipitación de proteínas se puede almacenar para su posterior análisis. El sobrenadante de este paso se somete a extracción líquido-líquido utilizandoagua y disolvente orgánico fuerte para separar los compuestos hidrófilos e hidrófobos. Una vez fraccionado, la capa hidrófila puede ser procesada para el análisis posterior o se descarta si no es necesario. La fracción hidrófoba se trata adicionalmente con una serie de disolventes durante tres etapas de extracción en fase sólida para separar en ácidos grasos, lípidos neutros y fosfolípidos. Esto permite que el técnico de la flexibilidad de elegir la que se prefiere clase de compuestos para su análisis. También ayuda en la identificación de metabolitos más fiable, ya un cierto conocimiento de que existe la clase química.
Las reacciones biológicas generan metabolitos como productos finales de los procesos celulares. Metabolómica es una colección de todos los compuestos presentes en un organismo como resultado de estos procesos. Proporciona una imagen de la fisiología de las células y refleja la respuesta de un organismo a estímulos externos o internos 1, 2. Tales estímulos pueden ser ambientales, toxicológicos, farmacológicos, dietéticos, hormonales, o relacionados con la enfermedad. Muchas aplicaciones de metabolómica tienen y están siendo estudiados por los investigadores e incluyen el descubrimiento de biomarcadores 3, 4 estudios de nutrición, ciencia de los alimentos 5, y las pruebas de drogas 6. Independientemente de la aplicación, las variaciones en los datos, la contaminación, y la presencia de falsos positivos necesitan ser reducido o preferiblemente eliminado. En el descubrimiento de biomarcadores o en el caso de la determinación de las diferencias entre un control y un grupo de enfermedad, o investigación de los efectos de los fármacos sobre los sujetos, un f biológicaluid se elige sobre la base de las preguntas que se hacen y los tipos de metabolitos siendo investigado 7. Por ejemplo, si el estudio de los efectos inmediatos de un fármaco inhalado en los pulmones de los asmáticos, a continuación, la exploración de metabolitos en el líquido de lavado broncoalveolar (BALF) muestras antes y después de la administración sería preferencial. Para garantizar que las diferencias observadas son debidas a la variación biológica real en lugar de la técnica de preparación de la muestra inadecuada, protocolo de laboratorio normalizado y coherente es esencial 8. Información de la muestra debe ser cuidadosamente documentado para asegurar que las variables tales como fluido biológico, la cepa animal, tiempo de muestreo, la edad del sujeto, de género, por nombrar unos pocos, son todos considerados y en cuenta en el estudio 9. Además, para reducir la posibilidad de contaminación o falsos positivos, se recomienda que los espacios en blanco de disolvente y espacios en blanco del instrumento se analizaron 10.
Para este protocolo, el término "metabolismolites "se utiliza para referirse a los compuestos reales identificados. El uso de software de proveedores, un algoritmo de pico inicial hallazgo se utiliza para detectar los picos del espectro de masas. Estos picos se alinean sobre la base de (m / z) Relación y la retención de masa a carga del tiempo. Un segundo algoritmo se utiliza entonces para combinar múltiples características en un solo compuesto. Esta incluye características tales como sodio, potasio, o aductos de amonio en el modo de ionización positiva, y cloruro en el modo de ion negativo. Las opciones adicionales en el software incluyen características tales como dímeros y otros aductos. El uso de la glucosa como ejemplo, con picos a 181.0707 m / z (M + H), 198,0972 m / z (M + NH4), y 203,05261 m / z (M + Na), habría tres picos correspondientes a la misma compuesto usando el primer algoritmo. Sin embargo, cuando el segundo algoritmo, que se basa en fórmula molecular, se aplica estos tres aductos se convierten agrupado resultante en un compuesto.
Los metabolitos pueden causar interferencias en sampLes debido a la complejidad de los compuestos presentes. La presencia de miles de metabolitos en una muestra de la señal de supresión de causas en particular de los metabolitos de menor abundancia. La limpieza de la muestra para eliminar la interferencia de proteínas, y la posterior separación en fracciones múltiples reduce la complejidad de la muestra mejorando de este modo la separación de pico, el aumento de resolución, y la reducción de la elución simultánea metabolito. Por lo tanto, se requiere la limpieza de la muestra y una mejor separación de los compuestos. Se ha demostrado que la precipitación de la proteína por sí sola, incluso con el uso de diversos disolventes de polaridad, no puede resolver este problema 11, 12. Sin embargo, mediante la combinación de un disolvente orgánico fuerte, tal como el MTBE con una etapa de fraccionamiento posterior, se aumenta la cobertura de metabolito. Yang et al. 12 reportaron un aumento de metabolitos de 1851 o 2073 con metanol o precipitación de metanol-etanol por sí sola, respectivamente, a 3.806 metabolitos mediante extracción con disolventes MTBE combinadoseguido de la extracción en fase sólida (SPE) pasos. Reducción de la superposición metabolito, la mejora de la separación máxima y mayor abundancia de metabolitos se observó con este método.
La contaminación de los no-metabolitos, tales como polímeros, puede ser resultado de la recogida de muestras, disolventes, o el ruido del instrumento, y puede resultar en supresión de la señal de metabolitos potencialmente significativos. Se recomienda que el técnico (s) y los que recogen las muestras antes de la preparación de la muestra utiliza constantemente la misma marca, tipo y tamaño de los frascos de recogida de muestras, puntas de pipetas y otros tubos utilizados durante la recolección y preparación de las muestras. Esto permite que el analista de datos para tener plena confianza de que los cambios observados son reales y no debido a las diferencias de fondo procedentes de otras fuentes. La efectividad del tratamiento, las variaciones entre las enfermedades y grupos de control, o cualquier otro análisis metabólicos pueden ser investigados con mayor confianza.
La metanfetaminaod discutido aquí se centra en los métodos de preparación de muestras combinadas de 13-15 que se pueden aplicar a la del plasma, BALF o líquido cefalorraquídeo (LCR) para las muestras de perfiles metabolómicos no dirigido por espectrometría de cromatografía-masa líquida (LCMS) análisis basado. Tanto la cromatografía líquida (LC) y la cromatografía líquida de ultra-desempeño (UPLC) técnicas de separación se pueden acoplar a MS después de este procedimiento. Muchos investigadores que realizan estudios metabolómicos utilizan ya sea una técnica de precipitación de proteínas y / o una técnica de extracción líquido-líquido 16, 17. En nuestros estudios, esto se tradujo en un menor número de metabolitos que se detectan. El método descrito aquí 12 permite la detección e identificación de un mayor número de metabolitos, que cubre una gama más amplia de la metaboloma. Este aumento se debe a la mayor pureza de las muestras y los efectos de matriz reducidos causados por la separación previa de las clases de metabolitos.
Un prot inicialetapa de precipitación ein se realiza usando metanol frío (MeOH) para eliminar la proteína de la muestra. Extracción líquido-líquido (LLE) utilizando metil terc-butil éter (MTBE) y el agua se utiliza para separar los compuestos hidrófilos e hidrófobos. Entonces extracción en fase sólida (SPE) se realiza en la capa hidrófoba para separar los compuestos hidrófobos en tres clases – ácidos grasos, lípidos neutros y fosfolípidos. Las fracciones hidrófobas se reconstituyen en metanol al 100%, mientras que la fracción hidrófila se reconstituye en acetonitrilo 5% en agua. La extracción (SPE) paso de fase sólida proporciona un nivel adicional de confianza en los resultados al reducir el número de compuestos coeluyentes que de otro modo estar presente no había una etapa de separación se lleva a cabo.
Uno de los objetivos de los estudios metabolómicos clínicos es identificar los cambios en el metabolome relacionados con la enfermedad o los tratamientos. Por lo tanto, las técnicas de preparación de muestras deben ser robustas, consistentes y transferibles de técnico a técnico y de un laboratorio a 22. Los datos resultantes debe ser representativa de la muestra, y cambios identificados deben reflejar la muestra establecida en lugar de errores de preparación de muestras. Por lo tanto precisa de pipeteado, la temperatura correcta, decantación eficiente de capas inmiscibles, secado en atmósfera de nitrógeno, y el uso de las mismas marcas y tamaños de artículos de vidrio y consejos son necesarios.
Durante la etapa de precipitación de proteínas, es crucial que la misma cantidad de solución se decantó de cada sedimento. Esto reduce la variación en volumen y, como tal, reduce la variación en los datos de muestra. Esta etapa de precipitación de proteínas es necesario para los estudios metabolómicos y no puede ser omitido ya que elimina la proteína delas muestras antes de la pequeña molécula de perfiles de análisis en el espectrómetro de masas. Elimina los patógenos y las grandes macromoléculas, y libera obligado metabolitos a partir de proteínas 7. La falta de acumulación de proteínas en las muestras se expande la duración de la columna de HPLC y aumenta la exactitud y calidad de los resultados. Figura 5 es una representación de la proteína de pellets formado al realizar esta técnica en muestras de plasma. Esto permite la detección de las moléculas pequeñas, aumenta la abundancia de iones, y reduce los efectos de matriz de proteínas en la muestra. Además, ya que se supone que todas las proteínas se eliminan en este paso, los aminoácidos que son detectados durante el análisis de LC-MS se originarían a partir de los cambios metabólicos en lugar de a partir de la descomposición de proteínas.
La etapa de extracción líquido-líquido es crítico ya que separa los metabolitos hidrófilos e hidrófobos en dos capas inmiscibles. La Figura 6 muestra el procedimiento de LLE y un representantesentación de la capa de LLE. Una separación inadecuada de las dos capas da lugar a metabolitos, ya sea que se pierden o se eluyó en dos fracciones. La aplicación cuidadosa de este paso reduce el número de compuestos hidrófilos que aparecen en la fracción hidrófoba. Los resultados para estos compuestos se convierten en poco fiables, ya que no se puede determinar que fracción contiene los resultados representativos. Cuando se hace correctamente, se reduce la superposición metabolito.
Para prevenir la degradación oxidativa, en particular en los lípidos, sino también en pequeñas moléculas que pueden contener grupos tiol por ejemplo, la exposición al oxígeno tiene que ser mantenido a un mínimo. Por lo tanto, este procedimiento siempre se lleva a cabo en atmósfera de nitrógeno para reducir / evitar la oxidación de lípidos o compuestos que contienen tiol. Además, la transferencia de la muestra y / o solución es rápida (dentro de la primera minutos) para reducir la exposición al oxígeno, a continuación, las muestras se colocan rápidamente bajo una corriente constante de nitrógeno para secar abajo. Una vez seco, que son inmediatamentetamente resuspendió en metanol al 100% por las razones anteriormente discutidos.
Los laboratorios pueden beneficiarse de este método integral en un número de maneras; Los investigadores que buscan aislar a una clase de compuestos pueden elegir la parte del método que mejor se adapte a sus necesidades. Aquellos que tratan de realizar sólo una precipitación de proteínas para obtener un conjunto de metabolitos pueden hacerlo. Si se desean metabolitos hidrófilos, tales como muchos fármacos, aminoácidos y azúcares, o si se desean sólo metabolitos hidrófobos, tales como triglicéridos, epóxidos, vitaminas solubles en grasa, y fosfolípidos, por ejemplo, a continuación, los investigadores pueden realizar la extracción líquido-líquido paso después de la precipitación de proteínas y deseche la fracción no deseado. Los investigadores que requieren mayor sub-clasificación de los compuestos hidrofóbicos (lípidos neutros, ácidos grasos y fosfolípidos) pueden pasar a la etapa de fraccionamiento.
Consideraciones sobre el almacenamiento son importantes en maintaining de la viabilidad de las muestras para su posterior análisis. Si las muestras se almacenan de forma incorrecta, pueden producirse degradación o descomposición. Idealmente, las muestras deben ser almacenadas en viales ámbar con tapón de rosca lejos de la luz para evitar la degradación de las especies sensibles a la luz. Las muestras también deben mantenerse congeladas a -80 ° C para evitar la degradación del metabolito 23-25. Aunque no se discute en detalle aquí, muestras siempre se mantienen a 4 ° C en la bandeja de inyector automático durante el análisis de LC-MS. Esto asegura que todas las muestras se mantienen a una temperatura constante y que los cambios en la temperatura ambiente no afectan a la viscosidad, solubilidad, o la estabilidad de las muestras. Se recomienda que los aspectos manuales de este procedimiento, como LLE y SPE, pueden practicar con el fin de ganar la confianza y la comodidad con los pasos a seguir.
Existen unas pocas limitaciones para esta técnica. Discreta separación de los metabolitos hidrofóbicos e hidrofílicos no está garantizada ya que ciertos compuestos voluntad inherentetemente particionar en ambas fracciones debido a su composición química y estado de carga. Además, como se muestra en la Figura 4, una técnica inadecuada durante la etapa de extracción de proteína de pellets puede resultar en una mala reproducibilidad metabolito en las muestras y de los controles de calidad. Esto afecta a las estadísticas, especialmente en pequeños conjuntos de datos debido a que el poder estadístico no está disponible. Por lo tanto, es crucial que este paso se lleva a cabo exactamente la misma hora todos para cada muestra. Otra limitación es el tiempo. Aunque hay puntos de parada a lo largo de este protocolo donde las muestras pueden ser congeladas y la preparación continuaron al día siguiente, un día entero debe dejarse de lado para llevar a cabo este procedimiento. En tercer lugar, no todos los compuestos dentro de una muestra biológica puede ser evaluado para la supresión de iones. Dado que no es posible identificar la forma en la matriz está afectando cada metabolito individual, la opción actual es el de evaluar las normas internas que teóricamente imitan algunas clases de endogenous metabolitos. Por último, las identificaciones absolutas no pueden realizarse únicamente con este método. Tandem MS en colaboración con las búsquedas y las normas de base de datos son necesarios para la identificación del metabolito absoluta.
Una parte importante de la metabolómica es la identificación de compuestos. Aunque no se discute en detalle aquí, se analizaron muestras de control de calidad utilizando LC-MS. Múltiples piezas en bruto de preparación de muestras y los espacios en blanco de instrumentos se prepararon para su uso como sustracción de fondo para reducir la tasa de falsos positivos de contaminantes, resultando así en los accesos de metabolitos más fiables. Después de esta etapa, se agrupó el número de "características moleculares" juntos sobre la base de m / z, tiempo de retención y la relación isotópica, y aductos de producir una lista de compuestos reales. Aunque la lista de compuestos se ha reducido en gran medida, los resultados eran más fiables, ya que no se basan en múltiples aductos de un mismo compuesto. El método completo es completo y permite isolation de metabolitos hidrófobos tales como lípidos neutros, fosfolípidos, ácidos grasos, triglicéridos, y los esteroides, mientras que también aislar clases hidrófilos en la fracción acuosa, de los cuales los eicosanoides, azúcares, flavonoides, aminoácidos y se han identificado 12, 26.
The authors have nothing to disclose.
El tutorial se presenta se realizó y desarrolló dentro de la facilidad de la base de Espectrometría de Masas de National Jewish Health. La instalación NJH MS es apoyado en parte por CCSTI UL1 TR000154. La financiación de las subvenciones del NIH P20 HL-113445 y R01 HL-095432 también apoya este trabajo.
Acetonitrile | Fisher Scientific | A955-4 | – |
Methanol | Fisher Scientific | L-6815 | – |
Chloroform | Fisher Scientific | C606-1 | – |
Hexane | Sigma Aldrich | 34859 | – |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 49199-50ML-F | – |
Methyl tert-butyl ether | J.T. Baker | 9042-03 | – |
Isopropyl alcohol | Sigma Aldrich | 34965-2.5L | – |
Water | Honeywell Burdick & Jackson | 365-4 | – |
OA-SYS heating system | Organomation Associates, Inc | – | Used to keep samples under a constant flow of nitrogen while at 35oC |
12-position vacuum manifold | Phenomenex | – | – |
Strata NH2 (55µM, 70Å) 100mg/mL SPE cartridges | Phenomenex | 8B-S009-EAK | – |
Glass pipette tips | Fisher Scientific | 13-678-20C | Used to transfer sample to SPE column |
Plastic pipette tips | USA Scientific | 1182-1830 | Used when glass tips are not necessary |
1182-8810 | |||
Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 02-681-320 | – |
Graduated glass pipets | Fisher Scientific | 13-678-27B | Used to transfer organic solvents during sample prep |
13-678-27E | |||
Pyrex glass culture tubes | Corning Incorporated | 99499-16X | Used to store aqueous and lipid fractions until the next step |
Autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0545 | – |
Snap cap vials for autosampler vials | Agilent Technologies | 5182-0541 | – |
Glass inserts | Agilent Technologies | 5183-2085 | Used for small sample volumes |
Mass Hunter Qualitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.06.00 | Used to monitor retention times and pressure curves |
Mass Hunter Quantitative Analysis software | Agilent Technologies | Version B.05.02 | Used to analyze quality control and sample data |
Mass Profiler Professional software | Agilent Technologies | Version B.12.50 | Used to determine statistics, fold changes, and perform metabolite identification |