Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा अलग वायुकोशीय मैक्रोफेज की एंटी फंगल गतिविधि का आकलन
Summary
Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा phagocytosed Aspergillus बीजाणुओं की वृद्धि को नियंत्रित करने के लिए अलग माउस वायुकोशीय मैक्रोफेज की क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक विधि.
Abstract
फेफड़ों मेजबान कोशिकाओं नियमित रोगाणुओं और सूक्ष्म उत्पादों को उजागर कर रहे हैं, जहां एक अंतरफलक है. वायुकोशीय मैक्रोफेज साँस कवक और अन्य रोगाणुओं मुठभेड़ कि पहली पंक्ति phagocytic कोशिकाओं रहे हैं. मैक्रोफेज और अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं रोगज़नक़ मान्यता रिसेप्टर्स द्वारा Aspergillus रूपांकनों को समझते हैं और नीचे की ओर भड़काऊ प्रतिक्रियाओं आरंभ. भक्षककोशिकीय NADPH oxidase प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन मध्यवर्ती (ROIs) उत्पन्न करता है और मेजबान सुरक्षा के लिए महत्वपूर्ण है. NADPH oxidase महत्वपूर्ण है न्युट्रोफिल की मध्यस्थता मेजबान बचाव के लिए 1-3, मैक्रोफेज में NADPH oxidase के महत्व को अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है. इस अध्ययन का लक्ष्य ए के खिलाफ मेजबान बचाव मध्यस्थता में मैक्रोफेज में NADPH oxidase की विशिष्ट भूमिका चित्रित करना था fumigatus. हम वायुकोशीय मैक्रोफेज में NADPH oxidase phagocytosed ए के विकास को नियंत्रित पाया कि fumigatus 4 spores. यहाँ, हम माउस एक की क्षमता का आकलन करने के लिए एक विधि का वर्णनphagocytosed Aspergillus बीजाणुओं (conidia) की वृद्धि को नियंत्रित करने के लिए lveolar मैक्रोफेज (एम्स). वायुकोशीय मैक्रोफेज विवो में दाग और दस दिन बाद ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना (बाल) द्वारा चूहों से अलग कर रहे हैं. मैक्रोफेज कांच coverslips पर चढ़ाया जाता है, तो हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) व्यक्त ए के साथ वरीयता प्राप्त fumigatus बीजाणुओं. निर्दिष्ट समय पर, कोशिकाओं तय कर रहे हैं और phagocytosed बीजाणुओं के साथ बरकरार मैक्रोफेज की संख्या confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया है.
Introduction
वायुकोशीय मैक्रोफेज साँस रोगाणुओं मुठभेड़ कि पहली पंक्ति phagocytic कोशिकाओं रहे हैं. मैक्रोफेज, रोगज़नक़ मान्यता रिसेप्टर्स द्वारा Aspergillus रूपांकनों पहचान निगलना और साँस बीजाणुओं (conidia) के विकास की सीमा, और भड़काऊ प्रतिक्रियाओं आरंभ. भक्षककोशिकीय NADPH oxidase superoxide आयनों और नीचे की ओर प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन मध्यवर्ती (ROIs) के लिए आणविक ऑक्सीजन धर्मान्तरित. पुरानी granulomatous रोग (सीजीडी) गंभीर बैक्टीरियल और फंगल संक्रमण से और अत्यधिक भड़काऊ प्रतिक्रियाओं द्वारा विशेषता NADPH oxidase की एक विरासत में मिला विकार है.
NADPH oxidase महत्वपूर्ण है न्युट्रोफिल की मध्यस्थता मेजबान बचाव के लिए 1-3, मैक्रोफेज में NADPH oxidase के महत्व को अच्छी तरह से परिभाषित नहीं है. पूर्व अध्ययनों neutrophils मुख्य hyphal चरण 5 को लक्षित जबकि वायुकोशीय मैक्रोफेज, निगलना और Aspergillus बीजाणुओं को मारने दिखाया है. हालांकि, परस्पर विरोधी resul वहाँ किया गया हैए की वृद्धि को नियंत्रित करने में बृहतभक्षककोशिका में NADPH oxidase की भूमिका के रूप में टीएस fumigatus 6, 7 spores.
इस पद्धति का लक्ष्य ए के खिलाफ मेजबान बचाव मध्यस्थता में मैक्रोफेज में NADPH oxidase की विशिष्ट भूमिका चित्रित करना था fumigatus बीजाणुओं. हम वायुकोशीय मैक्रोफेज में NADPH oxidase phagocytosed ए के विकास को नियंत्रित पाया कि fumigatus 4 spores. सबसे निकट साँस कवक के लिए मेजबान प्रतिक्रिया मॉडल के लिए, हम unstimulated चूहों से तुरंत त्याग निम्नलिखित ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना द्वारा काटा वायुकोशीय मैक्रोफेज इस्तेमाल किया. पृथक वायुकोशीय मैक्रोफेज का उपयोग vivo में Aspergillus के खिलाफ की रक्षा है कि अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं (जैसे, भर्ती neutrophils) की अनुपस्थिति में उनके रोधी गतिविधि पर ध्यान केंद्रित करने के लिए सक्षम होना चाहिए. इस विधि में, वायुकोशीय मैक्रोफेज के बाद फसल में गड़बड़ी की मात्रा को कम करने के रूप में तो फसल के लिए पूर्व vivo में दाग रहे थे. </ P>
इस प्रोटोकॉल के लिए एक और लाभ यह एक GFP-व्यक्त ए का इस्तेमाल होता है fumigatus तनाव. यह कवक hyphal मंच के माध्यम से conidial मंच से GFP व्यक्त किया और आगे धुंधला के लिए कोई जरूरत नहीं है. अधिक से अधिक विस्तार के साथ छवियों को प्राप्त करने के लिए, हम प्राप्त की छवियों से तीन आयामी संरचना के पुनर्निर्माण के लिए सक्षम बनाता है जो confocal माइक्रोस्कोपी चुना है. तीन आयामी पुनर्निर्माण hyphae एक बृहतभक्षककोशिका में या माध्यम से चारों ओर बढ़ रहा है बजाय के बीच अंतर करने की क्षमता देता है. Conidia भी बाह्य बनाम intracellular के रूप में ठीक से प्रतिष्ठित किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
साथ में इन विवो फंगल चुनौती से मैक्रोफेज की रोधी गतिविधि के पूर्व vivo विश्लेषण के लिए इस दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम पहले से मैक्रोफेज में NADPH oxidase ए के खिलाफ रक्षा करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका न?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ एलर्जी और संक्रामक रोग अनुदान R01AI079253 (बीएचएस के लिए) द्वारा समर्थित था, और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान में कैंसर केंद्र सहायता अनुदान CA016056 द्वारा Roswell पार्क कैंसर संस्थान के.
Materials
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Used to make AvertinAnesthetic |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma | A-1685 | Used to make AvertinAnesthetic |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| NH4CL | Sigma | A0171 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| KHCO3 | Sigma | P91444 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| EDTA | Sigma | E6758 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| 22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter | BD | 381523 | Insyte Autoguard Winged |
| insulin syringes | |||
| 6 ml syringes | |||
| 4-way stopcock | Fisher Scientific | 50-700-077 | |
| suture thread | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes | |||
| gauze sponges (4 inch square) | |||
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | heat inactivated |
| Hema 3 Stain Set | Fisher Scientific | 22-122-911 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | |
| Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants | BD | 297252 | |
| Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein | provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada | ||
| 100 micron Cell Strainers | BD Falcon | 64753-00 | |
| scissors | |||
| forceps | |||
| Biological Safety Cabinet Class II | |||
| Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor | |||
| Leica DM1000 light microscope | |||
| Hemocytometer | |||
| Cytospin 2 centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Cell Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| 22X22 mm micro cover glass | VWR | 48366-227 | glass coverslips |
| 6 well Cell Culture Plates | Corning | 3506 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-1LP | |
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Leica TCS SP2 system with a laser point scanner | Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope |
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