Messung der Stoffwechselrate in<em> Drosophila</em> Mit Respirationstest
Summary
Stoffwechselstörungen gehören zu einer der häufigsten Erkrankungen des Menschen. Die genetisch manipulierbaren Modellorganismus D. melanogaster kann verwendet werden, um neue Gene, die den Stoffwechsel regulieren, zu identifizieren. Dieses Papier beschreibt eine relativ einfache Methode, die die Untersuchung der Stoffwechselrate in Fliegen durch die Messung ihrer CO 2-Produktion ermöglicht.
Abstract
Stoffwechselstörungen sind ein häufiges Problem, die die menschliche Gesundheit. Daher ist das Verständnis der Mechanismen, die den Stoffwechsel regulieren, ist eine entscheidende wissenschaftliche Aufgabe. Viele krankheitsverursachenden Gene in Menschen haben eine Fliege Homolog, so dass Drosophila ein gutes Modell, um Signalwege in der Entwicklung verschiedener Erkrankungen beteiligt zu studieren. Zusätzlich wird die Lenkbarkeit von Drosophila vereinfacht genetische Screens bei der Identifizierung neuer therapeutischer Targets, die den Stoffwechsel regulieren kann helfen. Um einen solchen Bildschirm führen eine einfache und schnelle Methode, um Änderungen in der Stoffwechselzustand entfernt ist notwendig, zu identifizieren. Im allgemeinen ist die Produktion von Kohlendioxid ein guter Indikator für die Substratoxidation und Energieaufwand die Bereitstellung von Informationen über die Stoffwechsellage. In diesem Protokoll führen wir eine einfache Methode, um CO 2-Ausstoß von Fliegen messen. Diese Technik kann möglicherweise helfen bei der Identifizierung von genetischen Störungen beeinflussen die Stoffwechselrate.
Introduction
Die biochemischen Krebs-Zyklus erzeugt ATP durch Oxidation von Acetat aus Kohlenhydraten, Fetten und Proteinen produzieren CO 2 abgeleitet. In Drosophila, O 2-Eingang direkt mit CO 2-Ausstoß korreliert und spiegelt das Niveau des Stoffwechsels ein. So Messung der CO 2-Ausstoß ist erfolgreich in Studien zur Alterung und Stoffwechsel 2-5 Zusammenhang verwendet. Hier unser Labor zuvor entworfen Versuchsaufbauten modifiziert, so dass Messung von CO 2-Produktion in bis zu achtzehn Proben ohne jede Spezialausrüstung erfordern. Andere und wir haben auch bisher diese Methode, um Unterschiede in der Stoffwechselraten in den Fliegen, die einen Mangel in der Muskeldystrophie assoziierten Protein, Dystroglycan (Dg) 6-8 sind zu zeigen.
O 2 für oxidativen Stoffwechsel verwendet wird, in CO 2, der als Atemwegs Abfall ausgestoßen wird, umgewandelt wird. Der Baution von Hand hergestellt Respirometer beschrieben, die zur Bestimmung der Rate der O 2-Verbrauch kann. Fliegen werden in einem versiegelten Behälter mit einer Substanz, die CO 2 absorbiert vertrieben werden, mit dem gasförmigen Phase wirksam eliminieren. Die Änderung des Gasvolumens (verminderte Druck) wird durch die Verdrängung des Fluids in einer Glaskapillare mit dem geschlossenen Spiro angebracht war, gemessen.
Der Hauptvorteil dieses Verfahrens gegenüber anderen sind die Kosten. Frühere Studien haben CO 2-Produktion durch Drosophila mit Gasanalysatoren und technisch ausgereifte Systeme Respirometrie 1,9 gemessen. Trotz der komplexeren Geräten ist die Empfindlichkeit der hier beschriebenen Verfahren ähnlich berichteten Werten (Tabelle 1). Darüber hinaus haben mehrere andere Gruppen Varianten dieser Technik verwendet, um relative Stoffwechselraten in Drosophila 4-6 bestimmen. Daher kann dieser Assay verwendet werden, um verlässigen erzeugenle, relevant Drosophila Stoffwechsel ohne den Erwerb von Spezialgeräten, die Konfiguration für jedes Labor sein kann und für pädagogische Zwecke verwendet werden reproduzierbare Daten.
Im allgemeinen ist die akzeptierten Techniken, um den Stoffwechsel des Organismus zu bestimmen, messen die CO 2 erzeugt, das O 2 verbraucht oder beides 3,4,9. Obwohl, kann angenommen werden, daß ein Äquivalent von O 2 erzeugt ein Äquivalent von CO 2 ist, das genaue Verhältnis von CO 2 erzeugt wird, ist abhängig von der Stoffwechselsubstrat 10 verwendet. So ist es, um die Stoffwechselrate in Energieeinheiten notwendig, genau zu bestimmen, zu messen, sowohl O 2 verbraucht und CO 2 erzeugt. Aus diesem Grund ist das hier beschriebene Verfahren besonders relevant Vergleich Unterschiede in CO 2-Produktion von Tieren und der Absolutwert. Unsere Technik integriert mehrere Tier CO 2-Produktion über einen Zeitraum von time (1-2 Stunden) und damit gibt eine durchschnittliche Aktivität der Tiere. Wenn es einen Grund zu glauben, dass die Versuchstiere weniger aktiv als bei den Kontrolltieren konnten die Mess verschiedenen Ebenen der Aktivität und nicht unbedingt Stoffwechsel widerspiegeln.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Protokoll beschreiben wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode zur Messung der CO 2-Produktion in Fliegen. Wir fanden, dass dieses Experiment ist einfach, schnell durchzuführen und erzeugt reproduzierbare Daten, die in Übereinstimmung mit anderen Studien, 1, 6, 9 ist. Das hier beschriebene Protokoll kann leicht geändert werden, um Budget und verfügbaren Materialien jedes möglichen Labor passen. Die Konstruktion jedes einzelnen Respirometers kann, solange die Kammer luftdich…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten die Max-Planck-Gesellschaft für die Finanzierung unserer Forschung danken.
Materials
| BlauBrand IntraMark 50µl micropipettes | VWR | 612-1413 | |
| Soda Lime | Wako | CDN6847 | |
| Eosine | Sigma | 031M4359 | Any dye that can create visible colorization of liquid can be used |
| Thin Layer Chromatorgaphy (TLC) Developing Chamber | VWR | 21432-761 | Any transparent glass chamber that can be closed with the lid |
| Anesthetizer, Lull-A-Fly Kit | Flinn | FB1438 | |
| Power Gel Glue | Pritt | ||
| 1 ml pipett tips | Any | ||
| Foam | Any | ||
| Plaesticine Putty | Any | ||
| Scalpel | Any | ||
| Twezzers | Any |
Riferimenti
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