The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.
zebrafish वैज्ञानिक अध्ययन के कई विषयों के लिए प्रासंगिक है कि एक मुख्य धारा हड्डीवाला मॉडल बन गया है. Gastrulation से एक बुनियादी stereomicroscope साथ जीवोत्पत्ति को लेकर घटनाओं का प्रत्यक्ष अवलोकन सक्षम है कि लक्षण के एक नक्षत्र – Zebrafish विशेष रूप से अच्छी तरह से अपने बाह्य निषेचन, भ्रूण आकार, तेजी से व्यक्तिवृत्त, और ऑप्टिकल स्पष्टता के लिए विकास की प्रक्रिया के आगे आनुवांशिक विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं. इसके अलावा, zebrafish भ्रूण अगुणित राज्य में कई दिनों के लिए जीवित रह सकते हैं. यह पहली पीढ़ी के माता पिता (पी) पीढ़ी में mutagenesis के निम्नलिखित (एफ 1) महिला वाहकों में मौजूद हटने उत्परिवर्ती alleles की पहचान के लिए सक्षम बनाता के रूप में इन विट्रो में अगुणित भ्रूण के उत्पादन, उत्परिवर्तनीय विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है. यह दृष्टिकोण इस प्रकार कम करने के साथ साथ शोधकर्ता समय की बचत, कई पीढ़ियों उत्परिवर्ती परिवारों के प्रजनन शामिल है जो (आदि F2, F3,) जुटाने की आवश्यकता समाप्तzebrafish कॉलोनी अंतरिक्ष, श्रम, और पशुपालन की लागत के लिए की जरूरत है. Zebrafish पिछले कई दशकों के लिए स्क्रीन आगे का संचालन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, ट्रांसजेनिक और जीनोम संपादन उपकरण की एक सतत विस्तार किया गया है. इन उपकरणों अब आगे हड्डीवाला व्यक्तिवृत्त ड्राइव कि जीन विनियामक नेटवर्क काटना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि अगली पीढ़ी के स्क्रीन के लिए सूक्ष्म assays बनाने के तरीके के एक बहुतायत प्रदान करते हैं. यहाँ, हम अगुणित zebrafish भ्रूण तैयार करने के लिए क्या करते हैं. इस प्रोटोकॉल जल्दी भ्रूण चरणों के दौरान फार्म कि प्रक्रियाओं और ऊतकों की एक व्यापक संख्या के लिए विकास के तंत्र को संबोधित करने के लिए, ऐसे बढ़ाने और शमन स्क्रीन में ही उपन्यास भविष्य अगुणित स्क्रीन, के लिए लागू किया जा सकता है.
हड्डीवाला विकास आर्केस्ट्रा कि मौलिक प्रक्रियाओं मोटे तौर पर 1 संरक्षित कर रहे हैं. विकास में आवश्यक भूमिकाओं के साथ जीन की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली तरीका ब्याज की प्रक्रिया में प्ररूपी दोषों को जन्म दे कि पैतृक म्यूटेशनों अलग करने के लिए है. zebrafish, Danio rerio, पिछले कई दशकों से अधिक 2 हड्डीवाला विकास जेनेटिक्स के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल जीव बन गया है कि Cyprinidae मछली परिवार से संबंधित एक छोटे मीठे पानी teleost प्रजाति है. Zebrafish अंडे निषेचन 3 की शुरुआत से युग्मनज के लिए उपयोग की अनुमति, बाहर से निषेचित कर रहे हैं. इसके अलावा, जल्दी भ्रूण एक सरल stereomicroscope 3 के साथ विकास के दृश्य को सक्षम करने, ऑप्टिकली पारदर्शी है. Zebrafish व्यक्तिवृत्त दरार, gastrulation, और बड़े पैमाने पर विकास 3 के पहले दिन पर पूरा ऐसी दिल और गुर्दे के रूप में कई संरचनाएं, की जीवोत्पत्ति की प्रक्रियाओं के साथ, तेजी से है. टीवह यौन परिपक्वता के लार्वा चरणों से समय 2-3 महीने लग जाते हैं, और वयस्कों लंबाई में लगभग 3-4 सेमी, इतने सारे मछली न्यूनतम अंतरिक्ष 2 में बनाए रखा जा सकता छोटे रीढ़ हैं. इसके अलावा, zebrafish वयस्कों सप्ताह 2 प्रति कई सौ भ्रूण का उत्पादन करने में सक्षम प्रत्येक मछली के साथ, उच्च उपजाऊपन है. इन विशेषताओं आगे के लिए zebrafish के शिक्षणीयता गाया और आनुवंशिक स्क्रीन को उल्टा कर दिया है. Zebrafish उनके शरीर रचना विज्ञान, कोशिका जीव विज्ञान, और स्तनधारियों 2,4 तरह और अधिक उन्नत हड्डीवाला प्रजातियों के साथ शरीर क्रिया विज्ञान में संरक्षण के एक उच्च स्तर के अधिकारी. दरअसल, हाल ही अनुक्रम विश्लेषण zebrafish जीनोम मानव जीन 5 के लगभग 70% करने के लिए homologs होता है कि प्रदर्शन किया है. इस संरक्षण भ्रूण और वयस्क स्थितियों 2,4 दोनों सहित कई मानव रोगों, के लिए एक मॉडल के रूप में zebrafish का उपयोग करने के लिए शोधकर्ताओं के लिए सक्षम है. साथ में ले ली, इन कारकों है कि जीन की पहचान करने के उद्देश्य से स्क्रीन के लिए एक उत्कृष्ट प्रणाली zebrafish बना दिया हैसामान्य हड्डीवाला व्यक्तिवृत्त के लिए आवश्यक.
बड़े पैमाने पर स्क्रीन के एक नंबर zebrafish में बाहर किया गया है और विकास संबंधी जीन 6-8 में कई हजार उत्परिवर्तन की पहचान की है. zebrafish वयस्क पुरुष mutagenesis के लिए उत्तरदायी है, और गुणसूत्र परिवर्तन रासायनिक उत्परिवर्तजन ethylnitrosourea (ENU) 6,7 या रेट्रोवायरल insertional mutagenesis 9 का उपयोग अपेक्षाकृत उच्च आवृत्ति के साथ उत्पन्न किया जा सकता है. तिथि करने के लिए, 9,000 से अधिक पैतृक म्यूटेशन बनाया, और embryogenesis के लगभग सभी पहलुओं को प्रभावित करने वाले जीन शामिल किया गया है. zebrafish समुदाय दुनिया भर से लगभग 5,000 उत्परिवर्ती और ट्रांसजेनिक alleles एकत्र किया है जो Zebrafish अंतर्राष्ट्रीय संसाधन केंद्र (या Zirc) 10, पर इन म्यूटेंट की एक केंद्रीकृत बैंक की स्थापना की है. इन म्यूटेशनों से कई का विश्लेषण किया और जैविक विषयों में न्यूमरो अलग तंग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है कि बहुमूल्य जानकारी शोधकर्ताओं दे, क्लोन किया गया हैzebrafish प्रयोगों के साथ होने वाले अंतर्दृष्टि के माध्यम से हमें सेलुलर और शारीरिक मार्ग.
आगे स्क्रीन महत्वपूर्ण जीनों के एक प्रभावशाली संख्या की पहचान की है, बहुत प्रक्रियाओं के असंख्य कि मध्यस्थता आनुवंशिक विनियामक नेटवर्क के बारे में सराहना की अभी बाकी है. इस प्रकार अब तक किए गए कई स्क्रीन संतृप्ति तक पहुँच नहीं है, और इस तरह आगे और साथ ही रिवर्स आनुवंशिक स्क्रीन embryogenesis के तंत्र की पहचान और विश्लेषण करने के लिए एक आधार बना रहा है. किसी एक zebrafish उत्परिवर्ती लाइन से बटोरा जा सकता है कि जबरदस्त अंतर्दृष्टि रहे हैं, क्षेत्र में एक प्रमुख कारक सीमित ऐतिहासिक स्थितीय क्लोनिंग में शामिल समय लेने प्रयास किया गया है. इस कारण से, कई रासायनिक प्रेरित म्यूटेशन की पहचान एक रहस्य बनी हुई है. हालांकि, तेजी से क्लोनिंग 11-14 की सुविधा है कि पूरे जीनोम अनुक्रमण दृष्टिकोण के हाल के आगमन के साथ, आनुवंशिक परिवर्तन के अविश्वसनीय रूप से कुशल पहचान अब फ़े हैasible.
zebrafish में आद्य आगे स्क्रीन (चित्रा 1, स्तंभ छोड़ दिया) तीन पीढ़ियों 6,7 भीतर हटने का म्यूटेशन की पहचान कर सकते हैं कि एक द्विगुणित स्क्रीन है. इस तकनीक को पैतृक (पी) पुरुष के जर्म कोशिकाओं में पैदा म्यूटेशनों शामिल है, और फिर एक जंगली प्रकार महिला के साथ इस पुरुष संभोग. इस संभोग से पहले पीढ़ी (एफ 1) संतान के प्रत्येक उत्परिवर्तित पैतृक जीनोम के गुणसूत्र योगदान की वजह से एक या एक से अधिक अद्वितीय म्यूटेशनों बंदरगाह होगा. F1 संतान उठाया और F2 परिवारों बनाने के लिए जंगली प्रकार के साथ outcrossed रहे हैं. F2 परिवार में भाई बहन जंगली प्रकार या विषमयुग्मजी वाहक या तो हो जाएगा, और ब्याज के phenotype (ओं) के लिए विश्लेषण कर रहे हैं कि F3 चंगुल उत्पन्न करने के लिए बेतरतीब ढंग से incrossed रहे हैं. विषमयुग्मजी वाहकों के F3 चंगुल 25% जंगली प्रकार, 50% विषमयुग्मजी, और 25% homozygous उत्परिवर्ती मछली शामिल होंगे. यह बहु पीढ़ीगत स्क्रीनिंग स्कीमा बहरहाल, यह एक के लिए एक बड़ी खामी प्रभावी हैpproach स्क्रीन के लिए तैयार करने के लिए समय की आवश्यकता शामिल हैं: हर पीढ़ी यौन परिपक्वता तक पहुँचने के लिए 3 महीने के आसपास की आवश्यकता है, क्योंकि अकेले मछली पालन के लिए कम से कम 1 साल, शामिल है. द्विगुणित स्क्रीन के इस प्रकार के अन्य सीमाओं काम, अंतरिक्ष, और आवास की लागत इन पीढ़ियों हैं.
अगुणित स्क्रीन भी इसी mutagenesis रणनीतियों 15 (चित्रा 1, दाएँ स्तंभ) का उपयोग करते हुए पीछे हटने का म्यूटेशन की पहचान करने और बाद में अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक विकल्प है. अगुणित zebrafish भ्रूण का उत्पादन पहली बार 30 साल पहले 16 में वर्णित किया गया था, और एक अगुणित गुणसूत्र ploidy साथ कई दिनों के लिए विकसित करने के लिए सामान्य रूप से द्विगुणित zebrafish की क्षमता इस समय के बाद से कई आनुवंशिक अध्ययन के लिए उपयोग किया गया है. अगुणित स्क्रीन के प्रमुख लाभ इस विधि हटने उत्परिवर्ती alleles के लिए स्क्रीन के क्रम में F2 परिवारों को ऊपर उठाने को शामिल नहीं करता है. इसके बजाय, F1 पीढ़ी महिलाओं के लिए मूल्यांकन किया जाता हैएक अगुणित हालत में उनके F2 वंश (चित्रा 1, दाएँ स्तंभ) का परीक्षण करके ब्याज की प्रक्रिया में पीछे हटने का म्यूटेशन की heterozygosity. कुल मिलाकर, अगुणित भ्रूण की खरीद के लिए कदम (चित्रा 2) के अपेक्षाकृत सीधा कर रहे हैं. पेट से (या "निचोड़") अंडे बाहर निकालना के रूप में तो शुक्राणु से निपटने के लिए आवश्यक समाधान की तैयारी के बाद, अंडे मैनुअल हेरफेर करके F1 पीढ़ी महिलाओं से प्राप्त कर रहे हैं. अंडे प्राप्त कर रहे हैं, वे पराबैंगनी (यूवी) निष्क्रिय शुक्राणु के लिए जोखिम के लिए इन विट्रो में निषेचित कर रहे हैं. यूवी निष्क्रिय शुक्राणु के कारण छोटी तरंग दैर्ध्य यूवी पैतृक डीएनए crosslinks तथ्य यह है कि अंडे के लिए व्यवहार्य डीएनए योगदान के काबिल नहीं हैं. हालांकि, शुक्राणु अभी भी अंडे की गतिविधि और युग्मज विकास के साथ जुड़े घटनाओं को ट्रिगर करने में सक्षम हैं. चयापचय सक्रियण पर, अंडा अर्धसूत्रीविभाजन II पूरा, और प्रत्येक chromoso का केवल एक ही माता के रूप में जमा की नकल के साथ विकसित करने के लिए आगे बढ़ना होगामुझे. यह एक मातृ गुणसूत्र पर मौजूद है क्योंकि अगर इस 1N ploidy की, भ्रूण, एक पीछे हटने का उत्परिवर्ती एलील की विकासात्मक परिणामों के अधीन है. माँ एक पूरी तरह व्याप्ति हटने एलील की एक विषमयुग्मजी वाहक है, तो इस प्रकार प्रत्येक F2 अगुणित क्लच 50% wildtype और 50% उत्परिवर्ती भ्रूण शामिल होंगे. भ्रूण जीनोटाइप के इस वितरण में रुचि के उत्परिवर्ती phenotype (ओं) की उपस्थिति के लिए क्लच के मूल्यांकन के संदर्भ में रिश्तेदार आसानी सक्षम बनाता है. इस तरह के एक phenotype पाया जाता है, F1 पीढ़ी महिला संस्थापक बाद में अधिक विषमयुग्मजी वाहक बनाने और बढ़ाने के लिए जंगली प्रकार पुरुष zebrafish को outcrossed है. यह स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए कई पीढ़ियों को बढ़ाने के लिए आवश्यक नहीं है, क्योंकि शोधकर्ता काफी समय, श्रम, और मछलीघर स्थान बचा है, लेकिन अभी भी जांच की F1 महिलाओं की संख्या के आधार पर जीनोम का एक महत्वपूर्ण संख्या का सर्वेक्षण करने की शक्ति है सकते हैं. इस प्रकार, अगुणित स्क्रीन absenc में शुरू छोटे प्रयोगशालाओं या परियोजनाओं के लिए विशेष रूप से संभव हैंपर्याप्त धन के ए.
हालांकि, haploids का उपयोग करने के लिए कई सीमाएं और कमियां हैं. सबसे पहले, अगुणित zebrafish भ्रूण में ही कई दिनों तक रहते हैं, और आमतौर पर 3 और 5 के बीच दिनों के बाद निषेचन (DPF) 15 मर जाते हैं. अगुणित zebrafish भ्रूण सबसे पहले उन्हें फिर भी विखंड क्षेत्रों 15,17 की संख्या सामान्य है कि एक छोटी और गठीला शरीर जा रहा है के अलावा, कई विशेषताओं के आधार पर diploids से प्रतिष्ठित किया जा सकता. विकास की प्रगति, आमतौर पर 2-3 DPF और शोफ 15,17 से खून पूलिंग के साथ जुड़े, मस्तिष्क दर्शाती बढ़ कोशिका मृत्यु और परिसंचरण गरीब है. इसके अलावा, haploids तैरने मूत्राशय 15,17 बढ़ असफल. भले ही इन रूपात्मक मतभेद का सबसे प्रमुख अंगों और ऊतकों दिल, आंख, और पृष्ठदंड 15,17 सहित गठन कर रहे हैं. एक विशेषता यह अगुणित चंगुल बारे में उल्लेख किया है कि वे दोषपूर्ण भ्रूण & # की किस्मों के मामले में phenotypes की एक श्रृंखला शामिल है8212; एक सुविधा zebrafish उपभेदों भर में मनाया. ऊतक (एस) और ब्याज का समय बिंदु जंगली प्रकार अगुणित तनाव में यथोचित सामान्य विकास दिखाने यदि इस प्रकार, एक को सत्यापित करना चाहिए और इसलिए एक स्क्रीन या अन्य अनुसंधान परियोजना में आनुवंशिक दोष के लिए मूल्यांकन किया जाना संभावित है.
इन चुनौतियों के बावजूद, अगुणित स्क्रीन zebrafish में जल्दी विकास की प्रक्रिया के लिए आवश्यक जीन की पहचान करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है, और अगुणित प्रोटोकॉल अच्छी तरह से कई साल 15-19 के लिए समुदाय में संसाधनों की स्थापना की गई है. अभी हाल ही में अगुणित मछली भ्रूण पैदा करने की प्रक्रिया अगुणित भ्रूण स्टेम Medaka मछली 20,21 से (ते) सेल संस्कृतियों बनाने के लिए शोधकर्ताओं द्वारा इस्तेमाल किया गया है. इन विट्रो में Medaka अगुणित भ्रूण के उत्पादन के बाद, भ्रूण अगुणित कोशिकाओं का शुद्ध क्लोन के साथ उत्पन्न करने के लिए एक और 5-8 सप्ताह के बाद के बारे में 15 सप्ताह के लिए passaged गया कि प्राथमिक सेल संस्कृतियों प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गयाES सेल गुण 15-19. मछली अगुणित ES सेल लाइनों की पीढ़ी हड्डीवाला सेल प्रजातियों में पीछे हटने का phenotypes का विश्लेषण करने के लिए व्यापक भविष्य वादा रखती है, और आने वाले वर्षों में आनुवांशिक विश्लेषण के लिए एक नया दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है. इस प्रकार, अगुणित मछली भ्रूण की पीढ़ी के जैव चिकित्सा अनुसंधान समुदाय में आवेदन बढ़ रहा है. इस वीडियो लेख स्थापित प्रोटोकॉल 15-19,22 पर आधारित यूवी निष्क्रिय शुक्राणु का उपयोग इन विट्रो में अगुणित zebrafish भ्रूण उत्पादन के साथ शामिल कदम के एक दृश्य प्रदर्शन प्रदान करता है.
अगुणित स्क्रीनिंग जल्दी विकास के चरणों के लिए अपेक्षित आवश्यक जीन की खोज करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है. इसके अलावा, Medaka मछली से अगुणित कोशिकाओं के संवर्धन अगुणित कोशिकाओं हड्डीवाला आनुवंशिक अध्ययन 20,21 के अन्य प्रकारों के लिए एक मूल्यवान भविष्य स्थल प्रदान कर सकता है कि प्रदर्शन, कई अनुसंधान अनुप्रयोगों और क्षमता है कि ते तरह सेल लाइनों को अलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. इस प्रोटोकॉल यूवी निष्क्रिय शुक्राणु के साथ इन विट्रो निषेचन के माध्यम से अगुणित zebrafish भ्रूण का उत्पादन प्रदर्शन के साथ शामिल विधियों का एक प्रदर्शन प्रदान करता है. इस पद्धति को जंगली प्रकार, ट्रांसजेनिक या बढ़ाने / शमन स्क्रीनिंग के लिए उत्परिवर्ती उपभेदों का उपयोग किया जा सकता है जो mutagenized F1 मछली, के साथ आगे अगुणित स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
एक अगुणित रणनीति का प्रयोग स्क्रीनिंग समय बेहद द्विगुणित स्क्रीनिंग की तुलना में छोटा है, फिर भी यह पूरा करने के लिए कई महीनों का समय लगेगा. हम descri के रूप मेंपहले बिस्तर, विकासात्मक घटनाओं के किसी भी संख्या के बारे में वर्तमान ज्ञान के लिए उपन्यास योगदान बनाने में सहायता कर सकते हैं जो सभी के लिए एक अगुणित स्कीमा का उपयोग कर एक स्क्रीन प्रदर्शन से मौजूद है कि बहुत से लाभ हैं. अगुणित स्क्रीन कार्यप्रणाली के कारण समय, स्थान, और जरूरत है कि मछली की संख्या में कमी करने के लिए द्विगुणित आधारित स्क्रीन से हटने का उत्परिवर्ती alleles की पहचान के लिए और अधिक कुशल है. हालांकि, एक अगुणित स्क्रीन करने के लिए कई नुकसान कर रहे हैं. भ्रूण केवल एक अगुणित जीनोम के साथ एक सीमित समय के लिए जीवित रह सकते हैं के रूप में एक अगुणित स्क्रीन ही, विकास के पहले कुछ दिनों के भीतर सक्रिय हैं कि जीन में म्यूटेंट की पहचान कर सकते हैं. बाद में विकास में व्यक्त कर रहे हैं कि जीन एक द्विगुणित स्क्रीन के रूप में एक अलग तरीका है, के द्वारा की पहचान करने की आवश्यकता होगी. इसके अलावा, कुछ अंगों एक अगुणित जीव में ठीक से विकसित नहीं है. उत्परिवर्तन अगुणित स्क्रीनिंग तकनीक से चूक जाने का कारण बन सकता है जो संरचनात्मक असामान्यताएं, या विकास की एक देरी समय, हो सकता है. मैंn इसके अलावा, मछली के कुछ उपभेदों एक अगुणित हालत 15 में के रूप में अच्छी तरह से विकसित नहीं है. Haploids एक भ्रूण अक्ष में दोष के साथ भ्रूण को नामित करने का सबसे सामान्य, बी होने के साथ, अच्छा मध्यवर्ती और गरीब भ्रूण सुविधाओं की एक ग्रेडिंग श्रृंखला से वर्गीकृत किया जा सकता है, लेकिन एक स्पष्ट सिर और पूंछ, और सी / डी विक्षत साथ भ्रूण को नामित करने के लिए सुविधाओं (जर्दी गेंदों ऊपर कोशिकाओं की जनता) 15,17. इन श्रेणियों के भीतर भ्रूण के अनुपात विशेष आनुवंशिक पृष्ठभूमि 15,17 में अधिक प्रचलित बेहतर गुणवत्ता haploids की बढ़ी संख्या के साथ, zebrafish तनाव से भिन्न होता है. कारण इन कारकों के लिए, यह mutagenesis के और बाद के पार प्रदर्शन करने के लिए zebrafish के एक उचित तनाव को खोजने के लिए आवश्यक है. हाल ही में हमारे अनुभव में, जंगली प्रकार Tübingen तनाव स्क्रीनिंग के लिए व्यवहार्य haploids उत्पादन (3 आंकड़े और के रूप में दिखाया 4) ऐतिहासिक zebrafish शोधकर्ताओं अगुणित experim के लिए अटल बिहारी या अटल बिहारी * उपभेदों का उपयोग किया है, हालांकिentation 15.
इन aforementioned चुनौतियों के अलावा, नहीं सभी primed वयस्क zebrafish महिलाओं फैलाएंगे तकनीक के प्रदर्शन पर एक क्लच का उत्पादन होगा. उदाहरण के लिए, ENU-mutagenized Tübingen तनाव महिलाओं के साथ काम करने में, सभी महिलाओं की लगभग आधा फैलाएंगे पर एक क्लच का उत्पादन किया, और इनमें से कुछ अंश (आमतौर पर 10-30%) गरीब भ्रूण गुणवत्ता थे या निषेचित किया जा सका. इस प्रकार, एक अगुणित स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए एक जीनोम की वांछित संख्या (प्रत्येक महिला एक जीनोम जांच का प्रतिनिधित्व करता है) स्क्रीन के लिए जरूरत के रूप में कम से कम दो बार के रूप में कई मछली जुटाने की योजना बनानी चाहिए. परख अगुणित राज्य के लिए उत्तरदायी है अगर चाहे इस विचार से, एक बड़े पैमाने पर जानवरों की सुविधा के बिना जीनोम की बड़ी संख्या को कवर करने के लिए स्क्रीनिंग की अगुणित विधि का लाभ वास्तव में काफी महत्वपूर्ण हैं. हालांकि, यह भी अगुणित क्लच में पहचान उत्परिवर्तन (ओं) के आगे के अध्ययन के लिए सफलतापूर्वक एक को ऊपर उठाने पर पूरी तरह से निर्भर है कि ध्यान दिया जाना चाहिएमहिला संस्थापक एन outcross. किसी भी स्क्रीन के साथ के रूप में, द्विगुणित राज्य में फिर से पहचान की जानी चाहिए शुरू में जांच प्रक्रिया के दौरान पहचान की 'हिट'.
अगुणित स्क्रीन का उपयोग कर के नुकसान के बावजूद, यह वैज्ञानिक क्षेत्र से 15 व्यावहारिक लाभ के साथ गहराई में विश्लेषण किया गया है जो म्यूटेंट, की पहचान करने में बहुत सफल होना दिखाया गया है. अगुणित स्क्रीन हड्डीवाला विकास के अन्य खराब समझ प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है. बढ़ाने और शमन स्क्रीन के लिए haploids का प्रयोग गतिविधियों और ब्याज की एक जीन की विनियामक नेटवर्क में और अधिक जानकारी हासिल करने के लिए एक ही रास्ता है. अगुणित स्क्रीनिंग तकनीक भी enhancers और पहले से ही इस तरह के रासायनिक या insertional mutagenesis के रूप में तरीकों से अलग या आनुवंशिकी रिवर्स तिलिन्ग या TALENS तरह के दृष्टिकोण से किया गया है कि म्यूटेंट के दमन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. संक्षेप में, पहले से पृथक उत्परिवर्ती ENU साथ mutagenized किया जा सकता है और enhancers या एस के लिए जांचमूल उत्परिवर्ती phenotype की uppressors. उत्परिवर्ती वयस्क चरणों तक पहुँचने में सक्षम होना चाहिए, ताकि यह हालांकि transgenesis में हाल के अग्रिमों के शोधकर्ताओं ने इस समस्या से किनारा करने की अनुमति दी है, इस स्क्रीन प्रदर्शन करने के लिए एक विषमयुग्मजी जानवर या एक कमजोर homozygous उत्परिवर्ती मछली के लिए आवश्यक है. विकास में रास्ते में हेरफेर करने के लिए सीखने रोग राज्यों के इलाज के लिए perturbing रास्ते की संभावना सहित कई रोमांचक संभावनाओं को जन्म दे सकता है.
The authors have nothing to disclose.
इस काम के बाद से रॉ को धन के द्वारा समर्थित किया गया था: एनआईएच अनुदान K01 DK083512, DP2 OD008470, और R01 DK100237; ऑफ डाइम्स तुलसी O'Connor स्टार्टर विद्वान पुरस्कार # 5 FY12-75 के मार्च; विज्ञान और जीव विज्ञान विभाग के नोट्रे डेम कॉलेज के विश्वविद्यालय से धन शुरू; और Gallagher परिवार की ओर से एलिजाबेथ और माइकल Gallagher से नोट्रे डेम विश्वविद्यालय के लिए एक उदार उपहार स्टेम सेल अनुसंधान को बढ़ावा के लिए. funders अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशित करने का निर्णय, या पांडुलिपि की तैयारी में कोई भूमिका नहीं थी. हम उनके समर्थन के लिए जीव विज्ञान विभाग के कर्मचारी धन्यवाद, और हमारे zebrafish कॉलोनी की देखभाल और कल्याण में उनके उत्कृष्ट समर्पण के लिए नोट्रे डेम पर Zebrafish अनुसंधान के लिए केंद्र. हम चित्रा 4 में प्रदान की तस्वीरें लेने के लिए GF Gerlach धन्यवाद. अंत में, हम उनकी टिप्पणी, विचार विमर्श और insig के लिए हमारे अनुसंधान प्रयोगशाला के सभी सदस्यों को धन्यवादइस काम के बारे में HTS.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O | ||
Hank's Premix | Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 degrees Celcius. | ||
Hank's Stock Solution #6 | 0.35 g NaHCO3 in 10.0 mls ddH2O; make fresh on day of use. | ||
Hank's Final working solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
XX-Series UV Bench lamp | UVP | 95-0042-05 | Model XX-15S Bench Lamp |
XX Bench Stand (Adjustable) | UVP | 18-0062-01 | Model XX-15 Stand |
Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water | ||
Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000 |