Introduction
セルへの電流の印加は、エレクトロポレーションと呼ばれるプロセスにより、細胞膜上の細孔の形成を引き起こす。細孔は膜を通してnonpermeant多様な分子の通過を可能にする。形成された細孔が非常に小さく、細胞生理に最小限の妨害で、急速に再閉鎖するように電場が、正確に制御することができる。興味深いことに、接着細胞は懸濁液中でエレクトロポレーションすることが切り離されることなく、それらが成長する表面上にある導電性および透明なインジウム-スズ酸化物（ITO）でコーティングし、 その場で電気穿孔し、スライドガラス上に成長させることができる。細胞は、この表面上に非常によく成長することができ、そしてそれらが結合拡張されると、詳細な顕微鏡観察が可能である。この技術を用いて、小nonpermeant分子は、コンプの活性化に関する研究のためのこの技術は特に適しており、瞬時に細胞の本質的に100％に導入することができる（1件）受容体のリガンド刺激後の経路のonents。
エレクトロポレーション（electrotransfectionも呼ばれる）DNAの導入のために主に使用されてきた。しかしながら、in situでエレクトロポレーションが転写因子の結合、またはsiRNA 3,5阻害するためにアンチセンスRNA、二本鎖DNAデコイオリゴヌクレオチドなどのようなペプチド2-4、オリゴヌクレオチド分子は、多種多様の導入のために有益であることができ、 6、放射性ヌクレオチド7-10、タンパク質11 12またはプロドラッグ13。エレクトロポレーション後、細胞を生化学的分析のために溶解または固定し、抗体で染色することができる。
細胞は、導電性コーティングの縁を横切って成長するように、細胞増殖は、2つの表面の高さの差によって乱されないように導電性ITOコーティングは、800-1,000Å非常に薄い。これは、非electrop利点を提供していますorated細胞を対照として使用するために、エレクトロポレーションのものと並行して成長させることができる。ビデオと同様のアプローチは、ギャップ結合細胞間コミュニケーション（GJIC）の検査のために使用することができる。
ギャップ結合は、隣接するセル14の内部を接続するチャネルである。そのようなsrcと癌遺伝子がGJIC 15,16を抑制しながら、ギャップ結合は、細胞間の通信は、腫瘍形成および転移に重要な役割を果たしている。 GJICを調べるために、イエロールシファー（LY）のような蛍光色素は、多くの場合、マイクロインジェクションを介して培養細胞に導入したりこすっロード17と隣接するセルへの色素の拡散を顕微鏡、蛍光照明下で観察されている。これらの技術は、しかしながら、常に、細胞損傷を引き起こす。現在、細胞が部分的にITO 18で被覆されたガラススライド上で増殖させる技術が記載されている。電気パルスは、CA LY（または他の色素）の存在下で適用した隣接する、非エレクトロポレーションした細胞への染料の移動を顕微鏡、蛍光照明で観察しながら、スライドの導電部に増殖している細胞への浸透を使用して。単層から剥離する傾向が妨害感受性細胞を避けるために、電極を必要としない設計されたアセンブリは、電流19を印加するセルの上に配置される。このアプローチは、多数のセルにGJICを定量する能力を提供し、細胞代謝に検出可能な妨害なしに、血清刺激12を次のG1期の長さに対する効果の欠如によって示されるように、fosのレベルの増加癌原遺伝子タンパク質（ラプティス、未発表）、または細胞ストレス、p38の豚やJNK / SAPKキナーゼ1に関連付けられた2つのキナーゼ。このアプローチは、癌遺伝子発現、形質転換及びGJのレベルの間のリンクの検査を可能にしたIC 18と同様に、肺腫瘍標本20〜23から新たに培養した細胞を含む多様な細胞型におけるGJICの際にはSrcおよびStat3の効果。また、基板への細胞付着はその段階19,24で減少しているが、成功した脂肪細胞分化の際にギャップ結合閉鎖のデモンストレーションのために使用されている上部電極を欠いて説明した設定と、その場でのエレクトロポレーション。
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Protocol
1エレクトロポレーションチャンバー内の細胞をプレーティング
- 層流フード中で、いつものように、滅菌技術を用いて細胞をトリプシン処理。
注：これらは、したがって、ガラス上の細胞のアドヘレンとギャップ結合の形成を妨げる可能性が広がるので、それは、遠心分離によってトリプシンの痕跡をすべて排除することは非常に重要である。 - 37°Cの CO 2インキュベータ内で、その場でエレクトロ（ 図1）、および場所を提供無菌エレクトロポレーションチャンバー中の細胞懸濁液のピペット1ミリリットル。
注：細胞接着は、フィブロネクチン、コラーゲン、ポリリジン、または細胞および組織接着剤（材料表を参照）上にプレーティングすることによって改善することができる。 - 細胞がコンフルエント層を形成しているとき、彼らはGJIC試験の準備ができている。
2エレクトロポレーション手順
GJIC検査用エレクトロポレーションは、層流フードの外側に行うことができるそれはほんの数分かかりますので、。より長いインキュベーション時間は、特定の実験に必要とされる場合、それは層流フード内で完全に実施することができる。全ての場合において、細胞が増殖されるチャンバは無菌でなければならない。
- 5 mg / mlのルシファー黄色の溶液を準備します。2ミリリットルカルシウムを含まない増殖培地中で（エレクトロ付属）10mgのLY粉末を溶かす。より長いインキュベーション時間を必要とする実験のために、4℃。で溶液とストアをフィルター滅菌
- 増殖培地を吸引し、単層を傷つけたり、細胞を乾燥しないように注意して、カルシウムを含まない培地で細胞を洗浄。細胞が乾燥している場合は、彼らは通常より暗い核を持っているし、エレクトロポレーションすることなく、LYを拾う。効果はより多くの空気ドラフト（ 図4F）にさらされているスライドの途中でより顕著である。
- チャンバーの端にある細胞（全体のチャンバのための400μlの）へのエッペンドルフピペット、ピペット色素溶液において、a、bとの細胞層に触れないように注意しeing。
- エレクトロ付属のホルダーに室を置き、適度な強度（考察を参照）のパルスを適用します。
- 慎重にLY液の一部を吸引。これは、それほど重要での実験のために二度目に再使用することができる。
- 10％透析血清を含むカルシウムを含まないDMEMを追加します。
- ギャップ結合を介して色素転写を可能にするためにインキュベーター内で3〜5分間、細胞をインキュベートします。
注：この時点での透析血清を含むことは、気孔の閉鎖を支援します。 - 生細胞観察用のカルシウムを含まないDMEMで取り込まれていない色素を洗ってください。あるいは、細胞をPBS（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、その後、ウェルに4％ホルムアルデヒドの添加によって、この段階で固定することができる。すべての場合において、洗浄はすべてのバックグラウンドを削除する必要があります。
注：電圧が低すぎる場合に最適な条件を決定するための予備実験では、それは細胞がincubatoに回復させることが可能である数分間rとスライドのコスト節約するために、同じスライドをもう一度エレクトロポ。
3顕微鏡検査
- 使用されている染料のための適切なフィルターを装備した倒立顕微鏡を用いて、蛍光照明下で細胞を観察します。黄色ルシファーのために、励起が423nm、放射555nmの、ニコンIX70顕微鏡用WBVフィルタです。
- 位相コントラスト下の細胞形態を調べるために、液体でトップにそれを充填した後、穴プラスチックの上にガラスカバースリップを配置することによって、メニスカス効果を排除します。より良い写真のために、ウェルをスライドから取り外すことができ、カバースリップは、フレーム上に置いた。生きた細胞については、増殖培地で充填されなければならないが、固定した細胞については、ウェルは、顕微鏡観察のためにグリセロールを充填することができる。
注：細胞が色素（上記のステップ2.7）の転送以下のホルムアルデヒドで固定している場合は洗浄して撮影が容易になります。細胞がある場合はありませんtは固定、蛍光はLYの細胞タイプ、電圧、および量に応じて約60分以内に細胞から除去される固定された細胞に蛍光を数時間保持している間に導入した。しかし、蛍光が消えたり、固定した細胞では、O / Nインキュベートした後に消散する。このため、写真は、エレクトロポレーション（ 図2）の後にすぐに注意する必要があります。
細胞間コミュニケーションの4。定量
- 蛍光および位相差（ 図3）の下で20倍を目的とした細胞を撮影。
- 非電気穿孔面積（ 図2、矢印、エレクトロポレーションエッジ）との国境でのエレクトロポレーションした細胞を同定し、スターとマークします。
- 染料はギャップ結合を介して転送されている非電気穿孔側、上の蛍光細胞を特定し、ドットマーク（ 図3Aおよび3B）。
- の合計数で割り縁部（ 図3Aおよび図3B）に沿ってエレクトロポレーションした細胞の数で非エレクトロポレーション領域上の細胞を蛍光を発する。
注：少なくとも200個の連続電気穿孔境界セルからの転送を各実験について計算される。得られた数は、GJIC値です。
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Representative Results
図2は、固定および洗浄後、ラット肝臓上皮T51Bセル22、LYで電気穿孔し、蛍光（パネルAおよびB）下で撮影、または位相差（C）は、照明を示している。パネルAには、エレクトロポレーション領域のエッジは赤でマークされています。赤線の右側にある蛍光の勾配はギャップ結合を介して転送を示している。染料が転送された細胞は、ドットでマークしながら、エレクトロポレーション領域の端にある細胞は、星で識別し、マークした。図3Aと図3Bは、ギャップ結合コミュニケーションの定量を示している。比率は、染料がエレクトロポレーション境界セルあたりに移した細胞の平均数を示しています。この例では57ドットと10つ、 すなわち 、GJIC = 5.7があります。
CおよびD、転写-3のシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター（Stat3の）にT51B細胞tの中でダウンレギュレートされているレンチウイルスベクターによる安定したsiRNA発現hrough、及びトランスファ22の不在によって示されるように、これは、GJICの減少を引き起こす。
図1エレクトロポレーション電極とスライドアセンブリ。 （A）上面図：細胞を、導電性および透明なインジウム-スズ酸化物（ITO）でコーティングされたガラススライド上で増殖させる。プラスチック容器は、細胞およびLYための容器を形成するために、スライド上に接着されている。コーティングは、本質的に2つの電極を形成し、中央に直線状にレーザーエッチングする。ダムは、このように電界強度の急激な遷移を作成し、現在の上方を迂回するために使用される。非導電性領域を提供するために、ITOは、2つの矩形にエッチングされる。パルス発生器からの電流（赤い矢印）が直接に広がる、矩形間の導電性の高速道路を経由して、他の各接触点から流れ領域がダムにほぼ平行にイオンが細胞をエレクトロポレーション、もう一方の側に媒体を介しダムの上に、中間障壁に平行である。明確にするために、チャンバーの前方部分を除去し、（B）側面図。 ITOコート（ライトグリーン）、エッチングされた、裸のガラス領域上に成長している細胞を用いたスライドが表示されます。 （ - ）LYを含有するエレクトロポレーション培地は、次いで、ダムの高さの電極（+）との間の電気経路上のレベルにチャンバーに添加されると、この領域中で増殖する細胞が形成される。その実際の厚さ（800 A）はセルの厚さよりはるかに小さいが、ITO層は、明確性のために誇張厚さで示されていることに注意してください。（C）エレクトロポレーションおよび非エレクトロポレーションした細胞の面積が拡大して示されている。染料は、すべての細胞がエレクトロポレーションしたダムに近い緻密で濃度は、複数のギャップジャンクションTRANSFを通じて弱めるようにエレクトロポレーションし、エッジを越えフェードERS。大きな矢印は、ギャップ結合を介して色素転写の方向を示している。細胞の大きさや厚さを明確にするため誇張されていることに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
T51Bの図2エレクトロポ、ラット肝上皮細胞 。 LYはT51Bラット肝臓上皮細胞（軽度、12ボルト）にエレクトロポレーションした。 5分以下に示します。インキュベーション後、細胞を、蛍光（A、B）または位相コントラスト（C）照明下で撮影した。エレクトロポレーションエリア（矢印、A中の赤線）の端部から延びる、蛍光の勾配によって示されるギャップ結合を介して大規模な転送を、注意してください。同時に、細胞への目に見える損傷がaは、存在しない位相コントラスト（C）の下で見られるのは、この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ギャップ結合伝達の図3。定量 。エレクトロポレーション（非エレクトロポレーションした細胞へのLYのドナー）によってLYを拾ったエレクトロポレーション領域の端にある細胞は、星印が付いた。 LYはギャップ結合を介して中に移し、細胞を、ドットでマークされた。 （A）及び（B）において、57ドット、10つ、 すなわち、GJIC = 5.7である。蛍光の勾配が存在しないことによって示されるように（C）及び（D）の細胞は、ギャップ結合を有していない。矢印は、エレクトロポレーション領域のエッジを指す。バー=100μmである。ES / ftp_upload / 51710 / 51710fig3highres.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
操作中に掻き取ることにより被害を受けた、図4の（A）T51B細胞 。これらの細胞はさらに、エレクトロポレーションすることなく、LYを拾うことができ、ギャップ結合を介して彼らの隣人にそれを転送してもよい。（B）と強すぎるパルスによって損傷（C）細胞（B）T51Bのラット肝臓上皮細胞は、穏やかな設定でエレクトロポレーションした、20ボルト。エッチングされた線（矢印）の左側の細胞は、エレクトロポレーションによって損傷されています。この場合、細胞は位相コントラストの写真（中央のパネル、白矢印）でしかしよく見て、デタッチしませんでしたが、彼らは、非常に弱く蛍光を発するが、暗い核を持っている細胞を示すすべて（上のパネル）である場合。しかし、目を移すラフギャップ結合エレクトロポレーションされていない右側のセルに、明らかである。下部の写真は、エレクトロポレーションのエッジの観察を容易にするために、UV及び位相差照明を組み合わせることにより作製した。中程度の設定でエレクトロポレーションし（C）T51Bラット肝上皮細胞を、30ボルト。エッチングされた行の左側のセルは深刻なパルスによって損傷されています。細胞が脱落しており、蛍光を発しない方法に注意してください。エッジの周りいくつかの生存者はLYを拾い、ギャップ結合を介して、右に彼らの隣人にそれを渡しているように見えるしている。（D）T51B細胞を10μg/ mlのヨウ化プロピジウムでエレクトロ。核の強い染色に注意してください。上皮細胞の（E）のドーム。 T51B細胞は穏やかな設定で、15ボルトでエレクトロ。左のセルのさえエレクトロポレーションに注意してください。しかし、コンフルエント、T51B細胞は操作および洗浄中に外れることがありドームを形成し、周囲の細胞がtaされる場合がありますLYをKE。大規模な染料移動に注意してください。electroporation.The増殖培地なしでLYを拾うことが乾燥している（F）細胞をT51B細胞や細胞から除去し、30分間、層流フード内に放置した。 LYは、その後1分間細胞に添加し、細胞を、その後、固定し、洗浄し、蛍光（上のパネル）または位相差（下のパネル）照明下で撮影した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5のGrb2-SH2ブロッキングペプチドは無傷の生細胞におけるEGF媒介性Erk活性化を阻害する。 GJICおよびシグナル伝達の研究の組み合わせ。リガンド結合に続いて、そのような上皮成長因子撮影などの増殖因子受容体の数eptor（EGFR）は、特定のチロシン残基のトランスリン酸化されている。これらには、このようにして、膜にし、 ラスを活性化している、GTP / GDP交換因子SOSにバインドされたGrb2、などの信号変換器ののSrc相同性2ドメインのドッキング部位を構成している。これは、P TE P YシーケンスでのRaf / MEK / ERKカスケードおよびErkのリン酸化の活性化をもたらす。したがって、特定のホスホErkの抗体を用いてプロービングするEGF受容体の活性化の指標とすることができる。固定後、細胞を、ブラウンカラー29を与え、ビオチン結合二次抗体、ストレプトアビジン-ホースラディッシュペルオキシダーゼ-およびジアミノベンジジン基質、続いて、抗PERK抗体（Cellシグナリング）でプローブする。この実験では、Grb2は-SH2ドメイン（PVPE ページ Y INQS）をブロックリン酸化ペプチドは、 その場でのエレクトロポレーションiの中で紹介されましたNIH 3T3細胞はNTOは、エレクトロポレーションチャンバーと増殖停止済み培地中で成長している。 5分間のパルスの印加後に、細胞を、5分間EGFで刺激固定、明視野（上）または位相差（下）照明下で撮影した同じフィールドから免疫stainingand細胞によって活性化ホスホ-ERK1 / 2についてプローブ探査した。 （A領域）に劇的EGF信号を低減し、 すなわち 、Erkリン酸化たGrb2-SH2がペプチドをブロックしていることに注意してください。シグナルの阻害は、ギャップ結合を介して1123 Daのペプチドの移動に非エレクトロポレーションエリア（波線金具）に隣接するセルの3-4〜に行、おそらくを拡張します。この知見は、この領域の細胞は、任意の電流を受けるが、その隣人からのペプチドを取得していなかったので、観察された阻害は、むしろエレクトロポレーションの人工物よりも、原因ペプチドになければならないことを説得力のある証拠を構成している。同時に、細胞形態の際に検出可能な効果としては存在しない位相コントラストで示される。エレクトロポレーションエリアの端にポイントを矢印。倍率：240X。詳細とコントロールが参照29を参照してください。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
プロトコルの重要なステップ
電気穿孔材料
エレクトロポレーションされる材料の純度が非常に重要である。細胞は非常に平坦である場合には、追跡用色素のより高い濃度が使用されなければならない（LYための最大20 mg / ml）をそのような場合には、純度がより重要より球形1細胞よりなる。 LY以外に他の染料またはnonpermeant分子の多種多様なそのような異なるコネキシン25からなるチャネルのためのプローブとして使用するためのAlexa色素シリーズとして、使用されてきた。核は（ 図4D）色素転写の定量がより難しくなる、非常に強く蛍光を発するようにしたが、臭化エチジウムまたはヨウ化プロピジウムなどの染料は、DNAにインターカレートされている。カルシウム流入が接合通信を中断、ならびにセルを低減することができるので、トラッキング色素が調製されなければならず、洗浄は、カルシウムを含まない増殖培地中で実施lの生存率。すべての溶液は、細孔の閉鎖及び生存率1を容易にする、エレクトロポレーションの前に37°Cのに維持しなければならない。
最適電圧と容量の決定
電界強度は、細胞透過性、ならびに生存に重要なパラメータである。複数のパルスの印加は、単一パルスより浸透し、細胞生存率の点で良好な結果を提供することが示されている。マイルド（10パルス、離れて10マイクロ秒、パルス間の0.1秒）、中（20パルス、離れて80マイクロ秒、パルス間の0.2秒）とストロング（50パルス：セル·プロジェクトのその場ポレータ装置は、容量およびパルス数の3つの設定があります、離れて120マイクロ秒、パルス間の0.5秒）、電圧が細かく（2-45V）独立して制御することができるが。実際には、平らな細胞は、基層に小さな接着面積を持つ塊または細胞（ 例えば 、昆虫Sf9細胞）中で細胞を形質転換したものよりも低い電圧を必要とする、おそらく、より大きな導電性領域と接触している、拡張セルを通過する電流より多量に。このテーマの詳細については、1を参照してください。
潜在的な問題とトラブルシューティング
細胞が操作中に削り取られてきた場合は、染料をピックアップし、エレクトロポレーション（ 図4A）なしで蛍光を発することがあります。細胞に送達されるエネルギーの量は、エレクトロポレーションの効率に影響を与える。パルスが弱すぎる場合（ すなわち 、低すぎる電圧とパルスの設定）が、その後の細胞は、位相差下で正常に見えるが、それらは、おそらく死んであってもよく、または操作中に掻き取られてきた特定の細胞を除いて、蛍光を発しない（ 図4A） 。パルスが強すぎると、位相コントラスト細胞下非常に暗い核（ 図4B）を有するように見えるが、いくつかのLYを保持し、さらに隣接セルのいくつかの染料転写を可能にすることができる。前夜でnは、より高いパルスは、細胞（ 図4C）を破壊されます。このような細胞が溶解されているので、彼らはLYを保持しないと全然あれば、非常に弱い蛍光を発する。このような媒体の変更時に外れることがありT51Bフォームドーム構造などの特定の上皮細胞系。染料はギャップ結合（ 図4E）を介して転送することができるように、周囲の細胞を次に蛍光を発することがあります。代表的なラインのための最適エレクトロポレーション条件の例を表1に示す。
他の技術と意義に対する優位点
DNA導入
そのようなリポソームのカルシウム-リン酸共沈法26又は異種のようなトランスフェクションプロトコルは、多数がある。しかしながら、それらは、特にシグナル伝達研究のために、非常に重要であるかもしれない微妙な方法で細胞に影響を及ぼし得る。たとえば、シグナル伝達性転写物の活性化剤のTYR-705のリン酸化その転写活性と相関するイオン3（Stat3の）は劇的であってもDNAの非存在下でカルシウム - リン酸トランスフェクションの手順によって増加される。これは、沈殿物が細胞接着およびカドヘリンの関与、既知のStat3活性剤27細胞を変化させるという事実である可能性があります。エレクトロポレーションまたはレトロウイルス感染がStat3のレベル6には影響しなかった一部のリポソームは、似ていますが、それほど顕著な効果を持っていた。
ペプチドの導入
一般的な方法は、HIV-TAT遺伝子由来のような細胞膜を横切る配列との融合ペプチドの構成である。しかし、膜を通る移動は比較的遅いプロセスであり、信号の阻害は、効率的ではない。リガンドによって以下の受容体活性化を発生するイベントのシーケンスの研究のために、ペプチドの瞬間を導入するための能力は、ペプチド模倣または他の化合物は、重要なadvantagを提供していますメール。 FITC結合ペプチド（ラプティス、未発表）で明らかにされた親油性ペプチドは、細胞膜に埋め込まれているので、その取込みを促進する細胞透過性ペプチドのエレクトロポレーションは、可能性は低い。それは、（同じペプチドのエレクトロポレーションは、信号29の完全な阻害を達成しながら、例えばたGrb2-SH2ドメインをブロックする細胞透過性ペプチドの使用を通して、EGFによるErkの活性化の阻害は、28の一部だけだったことに注意することは興味深い。 図5）。リポソームに基づく他の技術は、存在してもいる。しかし、それらは、導入されている材料（ 図5、波線ブラケットにシグナル阻害がなければならないことを可能な限り強力なデモンストレーションを提供することができ、ギャップ結合の研究と関連して、処理されたものと並んで、未処理の細胞側の検査を許可していないと、c）。
ギャップ結合の研究
マイクロインジェクション染料またはスクレープローディングの一般的に用いられるが、それらは常に細胞の損傷を導入している。別の技術は、光退色後の蛍光回復は、侵襲的ではないが、それは高価な装置を必要とし、毒性物質の形成が問題かもしれないが、いくつかの細胞は、一度に検査することができる。パラシュートアッセイは、ギャップ結合は15分〜3時間以内に形成するように、その後、細胞は細胞層に付着させること、色素カルセインAM（緑色）で事前ロードセルで構成されています。多数のセルがこのように処理することができるが、このアッセイにおいて、ギャップジャンクションを形成する細胞の能力は、細胞型30と非常に変化する。
制限事項
必要な電圧がより大きなサイズと電荷の分子の導入のために高くなる。大きなプラスミドの導入に必要な高電圧では、いくつかの細胞死があってもよい。異なる分子に必要な相対電圧以前に9,12に記載されている。私たちは、特定のエレクトロポレーション装置を使用して、エレクトロポレーションを説明しているが、それは誰かが19に詳細な説明を使用してそれを作る、あるいは細胞上の上部電極との簡単なセットアップを行い、酸1をエッチングするための電気機器の使用経験が可能です。
今後の方向性
ソフトウェアは、正確にGJIC 31を定量するために開発されてきた。さらなる改善は、それらが細胞内に一旦取り込まれなかった色素を洗浄する必要がないように、のみ蛍光を発する量子ドットの開発である。プロセスは、リアルタイムでのライブ、固定されていない細胞で観察することができるが、これは洗濯のストレスを避けることができます。シグナル伝達経路を遮断するペプチドの導入は、精製された成分を使用して識別相互作用の関連性のin vivo評価のための強力なアプローチである。鍋の検討特定の経路を阻害する別のペプチドのentialは新生物の合理的な治療のためのペプチド模倣薬の開発における最初の重要なステップです。
その他のコメント
スライドを、ウェル中のITO表面に到達するための小さな絵筆を用いてエキストラン-1000溶液で洗浄し、そして水ですすぐことができる。細胞をスライド上に固定されている場合、それはまずトリプシンまたは他のタンパク質分解酵素を用いてタンパク質の痕跡を除去する必要があるかもしれない。ドデシル硫酸ナトリウムを含む洗剤は避けなければならない。洗浄したスライドは、過酸化水素ガスで滅菌することができる。任意LY溶液がホルダーに漏洩した場合には、ショートの原因となるので、それがスライド上のウェルの開封を避けるために非常に重要である。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro http://www.cellgro.com/ | 50-013-PB | |
| DMEM without Calcium | Hyclone (Thermo scientific: http://www.thermoscientific.com) | SH30319-01 | |
| Donor Calf Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# B15-008 | |
| Fetal Bovine Serum | PAA: http://www.paa.com/ | Cat.# A15-751 | |
| Electroporation apparatus | Cell Projects Ltd UK: http://www.cellprojects.com/ | ACE-100 | |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-04-CC | 4-wells |
| Chambers | Cell Projects Ltd UK | ACE-08-CC | 8-wells |
| Lucifer Yellow | Cell Projects Ltd UK | ACE-25-LY | High purity |
| CelTak | BD Biosciences | 354240 | Cell and tissue adhesive |
| Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Collagen | BD Biosciences | 354236 | |
| Poly-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
References
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