Expression av rekombinant Cellulas Cel5A från<em> Trichoderma reesei</em> I tobaksplantor
Summary
Tobaksplantor användes för att framställa ett svampcellulas, TrCel5A via ett transient expressionssystem. Uttrycket kan övervakas med hjälp av en fluorescerande fusionsprotein och proteinet aktivitet karakteriserades efter expression.
Abstract
Cellulosa nedbrytande enzymer, cellulaser, är måltavlor för både forskning och industriella intressen. Huvuddelen av dessa enzymer i svår kultur organismer, såsom hyfer skapande svampar och anaeroba bakterier, har påskyndat användning av rekombinanta tekniker inom detta område. Växtuttrycksmetoder är ett önskvärt system för storskalig produktion av enzymer och andra industriellt användbara proteiner. Häri beskrivs metoder för transient expression av en svamp endoglukanas, Trichoderma reesei Cel5A i Nicotiana tabacum påvisas. Framgångsrik proteinexpression visas, övervakas genom fluorescens med användning av en mCherry-enzym fusionsprotein. Dessutom är en uppsättning grundläggande tester som används för att undersöka aktiviteten av övergående uttryckt T. reesei Cel5A, inklusive SDS-PAGE, Western blotting, zymografi, samt fluorescens och färgbaserade substratnedbrytningsanalyser. Det system som beskrivs här kan användas för att producera en aktiv cellULASE i en kort tid, för att bedöma potentialen för ytterligare produktion i växter genom konstitutiva eller inducerbara expressionssystem.
Introduction
Nedbrytning av lignocellulosa och dess omvandling till flytande bränsle har tänkt som en metod för att minska beroendet av fossila bränslen. Ett betydande hinder i upprättandet ekonomiskt genomförbara behandlingssystemen för biomassa är i den enzymatiska nedbrytningen av cellulosa och hemicellulosa 1. Växtexpressionssystem visar stor potential för produktion av enzymer i industriell skala. Jordbrukssystem till skördeväxter ekonomiskt och i volym redan är etablerade, som de har varit i tusentals år. Produktionen av cellulaser i växter är önskvärt på grund av faktorer såsom hur lätt autohydrolysis 2, och potentialen för att maximera användningen av lägre enzymnivåer genom att öka smältbarheten av växtcellväggar 1. Slutligen växtsystem tillåter målinriktning av rekombinanta proteiner till specifika områden av växtceller och har möjlighet att posttranslationellt modifiera enzymer där krävs 3.
ve_content ">Nicotiana tabacum (tobak) är mycket vanligt förekommande som modellorganism för heterologa proteinexpressionsstudier i växter, på grund av sin snabba tillväxt och biomassa ackumulering har 4. Transient uttryck av rekombinanta proteiner är en teknik som gör att proteinproduktion i korta tidsperioder 5, samtidigt som flexibiliteten vad gäller lokalisering och därmed posttranslationella modifieringar av de utvalda proteiner, dvs cellulaser. Detta möjliggör produktion av cellulas (er) för grundläggande analys, samtidigt lägga grunden för ytterligare uttryck strategier i växter. Att använda en sådan transient expression strategi används en endoglukanas från glykosyl hydrolas familj 5, Cel5A, härledd från svampvärd Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) 6 som produceras (hädanefter kallad TrCel5A). TrCel5A är ett protein 42 kDa som nativt är glykosylerat och är mycket aktiv i hydroylzing cellulosakedjor 7.
Den transienta expressionstekniken beskriven här är baserad på ett relativt vanligt förekommande system infiltrerande växtbladen med Agrobacteria som bär genen av intresse i en lämplig expressionsvektor. För att möjliggöra snabb analys av framgångsrika in planta expression kan TrCel5A även uttryckas som ett fusionsprotein med mCherry, ett monomert fluorescerande protein som ursprungligen härrör från Discosoma sp. Protein DsRed 8, med ytterligare sex histidinrester (His-tag) fuserade till C-terminalen (TrCel5A-mCherry). Uttryck av den heterologa fusionsprotein, TrCel5A-mCherry, kan alltså övervakas inom den växande anläggningen med hjälp av grönt ljus för att undersöka mCherry spridning. Om så önskas kan tunna sektioner av växtmaterialet skall undersökas under grönt ljus i mikroskop för att fastställa den specifika lokaliseringen av proteinet. För detta arbete signal och transit peptider införlivades i konstruktionen, för att lokalisera den heterologa protein export till endoplasmatiska retiklet 9.
För att analysera aktiviteten av växt uttryckta cellulaser, inklusive TrCel5A ett antal cellulas aktivitetstester kan köras. Efter extraktion av de totala lösliga växtproteiner kan TrCel5A delvis renas genom användning av en termisk inkubation teknik. Protein storlek etableras med användning av SDS-PAGE följt av Western blotting. Zymografi kan användas för att analysera aktiviteten mot substrat, t ex cellulosa som har karboxi-metylerade (gör karboximetylcellulosa: CMC) och löslighet 10. Cellulas och glukosidas-aktivitet kan övervakas med användning av fluorofor 4-metylumbelliferyl (4-MU) associerad med β-D-cellobiosid (kombinerat: 4-MUC). En annan metod att bedöma endoglukanasaktivitet involverar den spektrometriska analysen av CMC som har associerats med en azo-dye (Remazolbrilliant Blue R) 11. Dessutom kan proteinaktivitet både endoglukanaser och ett utbud av cellulaser övervakas genom användning av en sockeranalystest, såsom p-hydroxibensoesyra-hydrazid (PAHBAH)-analys 12. Dessa tekniker kan användas för att belysa och kvantifiera aktiviteten hos den uttryckta cellulas av intresse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rekombinant expression av cellulaser är ett område av stort intresse, på grund av en önskan om mer effektiva biobränslen produktionssystem 1. Växter erbjuder många möjligheter för en lyckad cellulasproduktion, med funktioner som ekonomisk skördeteknik och autohydrolysis metoder vara mycket önskvärda egenskaper för storskalig produktion av biobränsle. Vidare användning av olika lokaliseringar för att producera proteiner tillåter, om så krävs, posttranslationella modifieringar 20. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av BMBF Forschungsinitiative "BioEnergie 2021 – Forschung für die Nutzung von Biomasse" och Cluster of Excellence "Skräddarsydda bränslen från biomassa", som finansieras genom Excellence Initiative av de tyska federala och statliga myndigheter för att främja vetenskap och forskning vid tyska universitet.
Materials
| 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| Acetic acid | ROTH | 3738 | |
| Acetosyringon (concentrated) | ROTH | 6003 | |
| Antibiotic – kanamycin | ROTH | T832 | |
| Antibiotic – rifampicin | ROTH | 4163 | |
| Antibiotic – carbenicillin | ROTH | 6344 | |
| Antibody – rabbit anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| Antibody – goat anti rabbit AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-cyclodextrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| Congo red | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie brilliant blue G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-glucose | ROTH | 8337 | |
| Ethanol | ROTH | K928 | |
| Filter paper – Rotilabo blotting paper | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| Methanol | ROTH | 8388 | |
| Sodium citrate | ROTH | 3580 | |
| Sodium dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
| Sodium hydroxide | ROTH | 6771 | |
| Soil, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| Spectrometer – Infinite M200 | TECAN | ||
| Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| Phosphate buffered saline | ROTH | 1058 | |
| UV light source – BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome – VT1000S | Leica |
Riferimenti
- Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
- Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
- Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
- Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
- Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
- Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
- Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
- Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
- Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
- Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
- Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
- Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
- Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
- Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets – procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
- Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
- Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
- Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
- Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O’Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).
