Expression von rekombinanten Cellulase aus Cel5A<em> Trichoderma reesei</em> In Tabakpflanzen
Summary
Tabakpflanzen wurden verwendet, um eine Pilz-Cellulase, TrCel5A erzeugen, über einen transienten Expressionssystem. Die Expression kann unter Verwendung eines fluoreszierenden Fusionsproteins überwacht werden, und die Proteinaktivität wurde nach der Expression charakterisiert.
Abstract
Zellulose abbauende Enzyme, Cellulasen, sind Ziele der Forschung und industriellen Interessen. Das Übergewicht dieser Enzyme in schwer Kulturorganismen wie Hyphen bild Pilze und anaeroben Bakterien, ist die Verwendung von rekombinanten Technologien in diesem Bereich beschleunigt. Pflanzenexpressionsverfahren sind ein wünschenswertes System zur großtechnischen Herstellung von Enzymen und anderen industriell nützlichen Proteinen. Hierin sind Verfahren für die transiente Expression eines Pilz-Endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A in Nicotiana tabacum demonstriert. Erfolgreiche Proteinexpression angezeigt wird, durch Fluoreszenz mit einem mCherry-Enzym-Fusionsproteins überwacht. Zusätzlich ist ein Satz von Basistests werden verwendet, um die Aktivität von transient exprimierten T. prüfen reesei Cel5A, einschließlich SDS-PAGE, Western Blot, Zymographie, wie Fluoreszenz-und farbstoffbasierten Substratabbau Assays. Das hier beschriebene System kann auf eine aktive Zelle verwendet werdenULASE in einer kurzen Zeitperiode, um so das Potential für die weitere Produktion in Pflanzen durch konstitutive oder induzierbare Expressionssysteme zu beurteilen.
Introduction
Der Abbau von Lignocellulose-Biomasse und deren Umwandlung in flüssigen Kraftstoff als ein Verfahren, um die Abhängigkeit von fossilen Brennstoffen verringern vorgestellt worden. Eine wesentliche Hürde bei der Gründung wirtschaftlich machbar Biomasse Verarbeitungssysteme ist in den enzymatischen Abbau von Cellulose und Hemicellulose ein. Pflanzenexpressionssystemen zeigen großes Potenzial für die Produktion von Enzymen im industriellen Maßstab. Landwirtschaftliche Anlagen bis zur Ernte Pflanzen wirtschaftlich und Volumen bereits etabliert sind, wie sie seit Tausenden von Jahren. Die Produktion von Cellulasen in Pflanzen aufgrund von Faktoren wie die Leichtigkeit der Autohydrolyse 2, und das Potential für die Maximierung der Verwendung von geringeren Enzymmengen durch die Erhöhung der Verdaulichkeit von Pflanzenzellwänden 1 wünschenswert. Schließlich Anlagensysteme ermöglichen die Ausrichtung von rekombinanten Proteinen, um bestimmte Bereiche von Pflanzenzellen und sind in der Lage, Enzyme posttranslational wo erforderlich 3 ändern.
ve_content ">Nicotiana tabacum (Tabak) ist sehr häufig als Modellorganismus für die heterologe Proteinexpressionsstudien in Pflanzen verwendet wird, durch sein schnelles Wachstum und Biomasseakkumulation verfügt über 4. Transiente Expression von rekombinanten Proteinen ist eine Technik, die die Proteinproduktion können in kurzen Zeitperioden 5, wobei die Flexibilität in Bezug auf die Lokalisierung und somit posttranslationale Modifikationen der Proteine ausgewählt, dh Cellulasen. Dies ermöglicht die Herstellung der Cellulase (n) für die Grundlagenanalyse, aber auch die Grundlagen für weitere Expressionsstrategien in Pflanzen. Unter Verwendung eines solchen transienten Expressionsstrategie ist eine Endoglucanase aus Glykosylhydrolase Familie 5, Cel5A von der Pilzwirts Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) abgeleitet 6 hergestellt (nachstehend als TrCel5A bezeichnet). TrCel5A ist ein 42 kDa Protein, das nativ glykosyliert ist und in hyd hochaktivenroylzing Celluloseketten 7.
Die transiente Expression Technik hier beschrieben wird, auf einem relativ häufigsten verwendete System basiert, Infiltrieren des Pflanzenblätter mit Agrobakterien, die das Gen von Interesse in einen geeigneten Expressionsvektor. Um für eine schnelle Analyse der in planta Ausdruck erfolgreich zu ermöglichen, können TrCel5A auch als Fusionsprotein mit mCherry, einer monomeren fluoreszierenden Protein ursprünglich aus Discosoma sp ausgedrückt werden. Protein DsRed 8, mit weiteren sechs Histidin-Reste (His-Tag) fusioniert der C-Terminus (TrCel5A-mCherry). Expression der heterologen Fusionsprotein, TrCel5A-mCherry, kann somit innerhalb der wachsenden Pflanze durch Verwendung von grünem Licht zu untersuchen mCherry Verbreitung überwacht werden. Wenn gewünscht, kann Dünnschnitte des Pflanzenmaterials unter grünem Licht mikroskopisch untersucht werden, um die spezifische Lokalisation des Proteins zu etablieren. Für diese Arbeit, Signal-und Übersitzen Peptide wurden in das Konstrukt eingebracht, um das heterologe Protein den Export nach dem endoplasmatischen Retikulum 9 lokalisieren.
Zur Analyse der Aktivität der Pflanze exprimiert Cellulasen, einschließlich TrCel5A eine Anzahl von Cellulase-Aktivitätstests ausgeführt werden kann. Nach der Extraktion der gesamten löslichen Pflanzenproteinen, kann TrCel5A teilweise unter Verwendung eines thermischen Inkubation Technik gereinigt werden. Proteingröße wird mit SDS-PAGE, gefolgt von Western-Blot etabliert. Zymographie kann verwendet werden, um die Aktivität gegen Gründen, z. B. Zellulose, die seit Carboxy-methylierte hat zu analysieren (was Carboxymethylcellulose: CMC) für die Löslichkeit 10. Cellulase und Glucosidase-Aktivität kann mit dem Fluorophor 4-Methylumbelliferyl-(4-MU) mit β-D-cellobiosid assoziiert (4-MUC kombiniert) überwacht werden. Ein weiteres Verfahren zur Endoglucanase-Aktivität zu beurteilen beinhaltet die spektrometrische Analyse der CMC, die mit einer Azo-d zugeordnet worden istihr (Remazolbrilliant Blue R) 11. Darüber hinaus können Protein-Aktivität beider Endoglucanasen und eine Reihe von Cellulasen, die durch die Verwendung einer Zuckeranalyse Test, wie der p-Hydroxybenzoesäure (PAHBAH) Test 12 überwacht werden. Diese Techniken können verwendet werden, um aufzuklären und Quantifizierung der Aktivität des exprimierten Cellulase von Interesse sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rekombinante Expression von Cellulasen ist ein Feld von großem Interesse, auf den Wunsch nach effizienteren Produktion von Biokraftstoffen Systeme ein. Pflanzen bieten viele Möglichkeiten für eine erfolgreiche Cellulaseproduktion, mit Funktionen wie wirtschaftliche Erntetechniken und Methoden Autohydrolyse sehr wünschenswerte Eigenschaften für eine groß angelegte Produktion von Biokraftstoffen. Ferner ist die Verwendung von verschiedenen Lokalisierungen zur Herstellung von Proteinen erlauben, falls erfo…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch das BMBF Forschungsinitiative unterstützt "BioEnergie 2021 – Forschung für sterben nutzung von Biomasse" und der Exzellenzcluster "Maßgeschneiderte Kraftstoffe aus Biomasse", die durch die Exzellenzinitiative des Bundes und der Länder gefördert wird, die Wissenschaft zu fördern und Forschung an deutschen Hochschulen.
Materials
| 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| Acetic acid | ROTH | 3738 | |
| Acetosyringon (concentrated) | ROTH | 6003 | |
| Antibiotic – kanamycin | ROTH | T832 | |
| Antibiotic – rifampicin | ROTH | 4163 | |
| Antibiotic – carbenicillin | ROTH | 6344 | |
| Antibody – rabbit anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| Antibody – goat anti rabbit AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-cyclodextrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| Congo red | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie brilliant blue G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-glucose | ROTH | 8337 | |
| Ethanol | ROTH | K928 | |
| Filter paper – Rotilabo blotting paper | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| Methanol | ROTH | 8388 | |
| Sodium citrate | ROTH | 3580 | |
| Sodium dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
| Sodium hydroxide | ROTH | 6771 | |
| Soil, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| Spectrometer – Infinite M200 | TECAN | ||
| Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| Phosphate buffered saline | ROTH | 1058 | |
| UV light source – BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome – VT1000S | Leica |
Riferimenti
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