संयोजक Cellulase Cel5A की अभिव्यक्ति से<em> ट्राइकोडर्मा reesei</em> तम्बाकू पौधों में
Summary
तम्बाकू पौधों एक क्षणिक अभिव्यक्ति प्रणाली के माध्यम से, एक कवक cellulase, TrCel5A निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया गया. अभिव्यक्ति एक फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन का उपयोग पर नजर रखी जा सकता है, और प्रोटीन गतिविधि के बाद अभिव्यक्ति की विशेषता थी.
Abstract
सेलूलोज़ अपमानजनक एंजाइमों, cellulases, अनुसंधान और औद्योगिक हितों दोनों का लक्ष्य कर रहे हैं. ऐसे hyphae निर्माण कवक और anaerobic बैक्टीरिया के रूप में मुश्किल को संस्कृति जीवों में इन एंजाइमों की प्रधानता है, इस क्षेत्र में पुनः संयोजक प्रौद्योगिकियों का उपयोग तेजी से किया गया है. संयंत्र अभिव्यक्ति के तरीकों एंजाइमों और अन्य औद्योगिक रूप से उपयोगी प्रोटीन का बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक वांछनीय व्यवस्था कर रहे हैं. इस के साथ साथ, तमाखू में एक कवक endoglucanase, ट्राइकोडर्मा reesei Cel5A, का क्षणिक अभिव्यक्ति के तरीकों के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं. सफल प्रोटीन अभिव्यक्ति एक mCherry एंजाइम संलयन प्रोटीन का उपयोग कर प्रतिदीप्ति द्वारा निगरानी, दिखाया गया है. साथ ही, बुनियादी परीक्षण का एक सेट transiently व्यक्त टी. की गतिविधियों की जांच करने के लिए उपयोग किया जाता है एसडीएस पृष्ठ, पश्चिमी सोख्ता, zymography, साथ ही प्रतिदीप्ति और डाई आधारित सब्सट्रेट गिरावट assays सहित reesei Cel5A,. यहाँ वर्णित प्रणाली एक सक्रिय सेल का उत्पादन किया जा सकता हैएक कम समय अवधि में ulase, विधान या inducible अभिव्यक्ति सिस्टम के माध्यम से पौधों में अधिक उत्पादन के लिए क्षमता का आकलन किया जा सके.
Introduction
Lignocellulosic बायोमास और तरल ईंधन में अपने रूपांतरण की गिरावट जीवाश्म ईंधन पर निर्भरता कम करने के लिए एक विधि के रूप में कल्पना की गई है. आर्थिक रूप से व्यवहार्य बायोमास प्रोसेसिंग सिस्टम स्थापित करने में एक महत्वपूर्ण बाधा सेलूलोज़ और hemicellulose 1 के enzymatic गिरावट में है. संयंत्र अभिव्यक्ति सिस्टम एक औद्योगिक पैमाने पर एंजाइमों के उत्पादन के लिए महान क्षमता दिखा. वे हजारों साल के लिए किया गया है के रूप में फसल पौधों आर्थिक और मात्रा में करने के लिए कृषि प्रणालियों पहले से ही स्थापित कर रहे हैं. पौधों में cellulases के उत्पादन की वजह से autohydrolysis 2 में आसानी, और संयंत्र सेल दीवारों 1 की पाचनशक्ति में वृद्धि से कम एंजाइम का स्तर के उपयोग को अधिकतम करने के लिए क्षमता जैसे कारकों के लिए वांछनीय है. अंत में, संयंत्र प्रणालियों संयंत्र कोशिकाओं के विशिष्ट क्षेत्रों को पुनः संयोजक प्रोटीन को निशाना अनुमति देते हैं और posttranslationally 3 जहां आवश्यक एंजाइमों को संशोधित करने में सक्षम हैं.
"ve_content>तमाखू (तम्बाकू) बहुत सामान्य कारण इसका तेजी से विकास और बायोमास संचय सुविधाओं से 4, पौधों में heterologous प्रोटीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया जाता है. पुनः संयोजक प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति स्थानीयकरण के रूप में लचीलापन बनाए रखने और इस प्रकार चयनित प्रोटीन, यानी cellulases की posttranslational संशोधनों, जबकि कम समय अवधि 5 में प्रोटीन के उत्पादन में सक्षम बनाता है जो एक तकनीक है. यह भी पौधों में आगे अभिव्यक्ति रणनीतियों के लिए नींव बिछाने, जबकि बुनियादी विश्लेषण के लिए cellulase (एस) के उत्पादन में सक्षम बनाता है. इस तरह के एक क्षणिक अभिव्यक्ति रणनीति का प्रयोग, कवक होस्ट ट्राइकोडर्मा reesei (Hypocrea jecorina) से व्युत्पन्न glycosyl hydrolase परिवार 5, Cel5A, 6 से एक endoglucanase (इसके बाद TrCel5A के रूप में) का उत्पादन किया है. TrCel5A natively ग्लाइकोसिलेटेड है जो एक 42 केडीए प्रोटीन होता है और हैदराबाद में अत्यधिक सक्रिय हैसेल्यूलोज चेन 7 roylzing.
यहाँ वर्णित क्षणिक अभिव्यक्ति तकनीक संयंत्र Agrobacteria एक उपयुक्त अभिव्यक्ति वेक्टर में ब्याज की जीन ले जाने के साथ छोड़ देता है घुसपैठ, एक अपेक्षाकृत अधिक इस्तेमाल किया प्रणाली पर आधारित है. Planta अभिव्यक्ति में सफल का तेजी से विश्लेषण के लिए अनुमति देने के लिए, TrCel5A भी mCherry, मूल रूप से Discosoma सपा से व्युत्पन्न एक मोनोमेरिक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ एक संलयन प्रोटीन के रूप में व्यक्त किया जा सकता है. प्रोटीन के लिए जुड़े हुए एक अतिरिक्त छह हिस्टडीन अवशेषों (उनकी टैग) के साथ, 8 DsRed सी टर्मिनस (TrCel5A-mCherry). Heterologous संलयन प्रोटीन, TrCel5A-mCherry की अभिव्यक्ति इस प्रकार mCherry प्रसार की जांच करने के लिए हरी बत्ती का उपयोग करके बढ़ संयंत्र के भीतर नजर रखी जा सकती है. अगर वांछित, संयंत्र सामग्री की पतली वर्गों प्रोटीन की विशिष्ट स्थानीयकरण स्थापित करने के लिए microscopically हरी बत्ती के तहत जांच की जा सकती. इस काम है, संकेत और ट्रॅन के लिएबैठने पेप्टाइड्स जालिका 9 को heterologous प्रोटीन निर्यात स्थानीयकरण करने, निर्माण में शामिल किया गया.
Cellulase गतिविधि परीक्षणों के एक नंबर चलाया जा सकता है TrCel5A, सहित संयंत्र व्यक्त cellulases, की गतिविधि का विश्लेषण. कुल घुलनशील संयंत्र प्रोटीन की निकासी के बाद, TrCel5A आंशिक रूप से एक थर्मल ऊष्मायन तकनीक का उपयोग कर शुद्ध किया जा सकता है. प्रोटीन आकार पश्चिमी सोख्ता द्वारा पीछा एसडीएस पृष्ठ का उपयोग कर स्थापित कर रहा है. घुलनशीलता 10 के लिए: (सीएमसी Carboxymethyl सेलूलोज़ बनाने) zymography substrates, carboxy-methylated किया गया है जो जैसे सेल्यूलोज के खिलाफ गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Cellulase और ग्लुकोसिडेस गतिविधि (4-MUC संयुक्त) β-D-cellobioside के साथ जुड़े फ्लोरोफोरे 4-methylumbelliferyl (4 यू) का उपयोग पर नजर रखी जा सकती है. Endoglucanase गतिविधि का आकलन करने के लिए एक अन्य विधि एक AZO-D के साथ संबद्ध किया गया है जो सीएमसी के spectrometric विश्लेषण शामिलतु (Remazolbrilliant ब्लू नि.) 11. इसके अलावा, endoglucanases और cellulases की एक सीमा के दोनों प्रोटीन गतिविधि P-हाइड्रोक्सी benzoic एसिड hydrazide (PAHBAH) परख 12 के रूप में एक चीनी विश्लेषण परीक्षण के उपयोग, द्वारा नजर रखी जा सकती है. इन तकनीकों में ब्याज की व्यक्त cellulase की गतिविधि को स्पष्ट और यों इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellulases के संयोजक अभिव्यक्ति के कारण अधिक कुशल जैव ईंधन उत्पादन प्रणाली 1 के लिए इच्छा के लिए, बहुत रुचि का एक क्षेत्र है. पौधे इस तरह के आर्थिक संचयन तकनीक और बड़े पैमाने पर जैव ईंधन के उत्पादन के लिए बह?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम BMBF Forschungsinitiative द्वारा समर्थित किया गया था "BIOENERGIE 2021 – Forschung फर Nutzung वॉन Biomasse मरने" और विज्ञान को बढ़ावा देने के लिए जर्मन संघीय और राज्य सरकारों द्वारा उत्कृष्टता पहल के माध्यम से वित्त पोषित है जो उत्कृष्टता "बायोमास से दर्जी ईंधन", के क्लस्टर और जर्मन विश्वविद्यालयों में अनुसंधान.
Materials
| 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| Acetic acid | ROTH | 3738 | |
| Acetosyringon (concentrated) | ROTH | 6003 | |
| Antibiotic – kanamycin | ROTH | T832 | |
| Antibiotic – rifampicin | ROTH | 4163 | |
| Antibiotic – carbenicillin | ROTH | 6344 | |
| Antibody – rabbit anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| Antibody – goat anti rabbit AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-cyclodextrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| Congo red | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie brilliant blue G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-glucose | ROTH | 8337 | |
| Ethanol | ROTH | K928 | |
| Filter paper – Rotilabo blotting paper | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| Methanol | ROTH | 8388 | |
| Sodium citrate | ROTH | 3580 | |
| Sodium dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
| Sodium hydroxide | ROTH | 6771 | |
| Soil, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| Spectrometer – Infinite M200 | TECAN | ||
| Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| Phosphate buffered saline | ROTH | 1058 | |
| UV light source – BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome – VT1000S | Leica |
Riferimenti
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