Expression of rekombinant Cellulase Cel5A fra<em> Trichoderma reesei</em> I tobakksplanter

Summary

Tobakksplanter ble brukt til å produsere en fungal cellulase, TrCel5A, via et transient ekspresjonssystem. Uttrykket kan bli overvåket ved hjelp av en fluoriserende fusjonsprotein, og proteinaktiviteten ble karakterisert etter ekspresjon.

Abstract

Cellulose nedbrytende enzymer, cellulaser, er mål for både forskning og industrielle interesser. Det meste av disse enzymene i vanskelige til-kultur organismer, slik som hyfer byggende fungi og anaerobe bakterier, har påskyndet ved bruk av rekombinant teknologi på dette området. Plant expression metoder er en ønskelig system for storskala produksjon av enzymer og andre industrielt nyttige proteiner. Heri er metoder for transient ekspresjon av en sopp-endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, i Nicotiana tabacum demonstrert. Vellykket protein uttrykk vises, overvåket av fluorescens ved hjelp av en mCherry-enzym fusjonsprotein. I tillegg er et sett grunntester brukt til å undersøke aktiviteten til forbigående uttrykt T. reesei Cel5A, inklusive SDS-PAGE, Western blotting, zymography, så vel som fluorescens-og fargestoffbaserte substrat degradering analyser. Systemet som er beskrevet her kan brukes til å frembringe en aktiv celleulase i en kort tidsperiode, slik som å vurdere potensialet for videre produksjon i planter gjennom konstitutive eller induserbare ekspresjonssystemer.

Introduction

Nedbrytning av lignocellulose biomasse og dens konvertering til flytende drivstoff har blitt tenkt som en metode for å redusere avhengigheten av fossilt brensel. En vesentlig hinder i å etablere økonomisk gjennomfør biomasse behandlingssystemer er i enzymatisk nedbrytning av cellulose og hemicellulose ^en. Plant ekspresjonssystemer viser et stort potensial for produksjon av enzymer i en industriell skala. Landbruk systemer til slakteanlegg økonomisk og i volum er allerede etablert, som de har vært i tusenvis av år. Produksjonen av cellulaser i planter er ønskelig på grunn av faktorer som den enkle autohydrolysis ^2, og potensialet for å maksimere bruken av lavere enzymnivåer ved å øke fordøyeligheten av plante-cellevegger ^en. Til slutt, plante-systemer tillater målretting av rekombinante proteiner i bestemte områder av planteceller og er i stand til å posttranslationally endre enzymer der kreves ^tre.

ve_content ">

Nicotiana tabacum (tobakk) er svært ofte brukt som modellorganisme for heterologe protein expression studier i planter, på grunn av sin raske vekst og biomasse akkumulering funksjoner ^fire. Transient ekspresjon av rekombinante proteiner er en teknikk som gjør det proteinproduksjon i korte tidsperioder ^5, og samtidig opprettholde fleksibilitet med hensyn til lokalisering og dermed posttranslational modifikasjoner av de utvalgte proteiner, dvs. cellulaser. Dette muliggjør produksjon av en cellulase (r) for grunnleggende analyse, og samtidig legge forholdene til rette for ytterligere uttrykk strategier i planter. Ved hjelp av en slik forbigående uttrykk strategi, er en endoglucanase fra glycosyl hydrolase familien 5, Cel5A, avledet fra soppens verten Trichoderma reesei (Hypocrea jecorina) ⁶ produsert (heretter kalt TrCel5A). TrCel5A er et 42 kDa protein som er nativt glykosylert og er svært aktive i hydroylzing cellulosekjedene ^7.

Den forbigående ekspresjon teknikk som er beskrevet her er basert på en forholdsvis vanlig brukt system, infiltrere anlegget blader med Agrobacteria bærer genet av interesse i en passende ekspresjonsvektor. For å muliggjøre rask analyse av vellykket i planta uttrykk, kan TrCel5A også uttrykkes som et fusjonsprotein med mCherry, en monomerisk fluorescerende protein opprinnelig stammer fra Discosoma sp. Protein DsRed ^8, med ytterligere seks histidin rester (Hans-tag) smeltet til C-terminalen (TrCel5A-mCherry). Ekspresjon av det heterologe fusjonsproteinet, TrCel5A-mCherry, kan således bli overvåket i løpet av den voksende planten ved hjelp av grønt lys for å undersøke mCherry spredning. Hvis ønskelig, kan tynne snitt av plantematerialet bli undersøkt under grønt lys mikroskopisk for å etablere den spesifikke lokaliseringen av proteinet. For dette arbeidet, signal og transitte peptider ble innlemmet i konstruksjonen, for å lokalisere den heterologe protein eksport til det endoplasmatiske retikulum ^ni.

For å analysere aktiviteten av plante uttrykt cellulaser, inkludert TrCel5A, en rekke cellulase aktivitetstester kan kjøres. Etter ekstraksjon av den totale oppløselige planteproteiner, kan TrCel5A bli delvis renset ved anvendelse av en termisk inkubasjon teknikk. Protein størrelse er etablert ved hjelp av SDS-PAGE etterfulgt av Western blotting. Zymography kan brukes til å analysere aktivitet mot substrater, f.eks cellulose som har vært karboksy-metylert (gjør karboksymetylcellulose: CMC) for oppløseligheten ^10. Cellulase, og glukosidase-aktivitet kan overvåkes ved hjelp av fluoroforen 4-methylumbelliferyl (4-MU) forbundet med β-D-cellobioside (kombinert: 4-AMS). En annen metode for å vurdere endoglucanase aktivitet involverer spektrometrisk analyse av CMC som er blitt forbundet med en azo-dye (Remazolbrilliant Blå R) ^11. I tillegg kan protein-aktivitet av både endoglucanases og en rekke cellulaser overvåkes ved bruk av en sukkeranalyse test, som for eksempel p-hydroksy benzosyre-hydrazid (PAHBAH) assay ^12.. Disse teknikker kan brukes til å belyse og kvantifisering av aktiviteten til uttrykt cellulase av interesse.

Protocol

En. Vekst av vill type N. tabacum Planter Å vokse N. tabacum L. cv. Petit Havana SR1 planter på jord, plassere tobakk frø på egnede potter fylt med vanlig pottejord for spiring. Etter to uker, overføre frøplanter til individuelle potter. Inkuber planter i et drivhus med konstant 22 ° C (mørketiden) eller 25 ° C (lys periode) og 70% relativ luftfuktighet. Gi belysning i en 16/8 timers lys / mørke-syklusen (f.eks Philips IP65 400 W lamper, 180 mikromol · sek -1 ?…

Representative Results

TrCel5A og TrCel5A-mCherry ble uttrykt hell i tobakksplanter bruker gående uttrykk systemet (figur 1A og 1B). Undersøkelse av uttrykket mønster av TrCel5A-mCherry fusjonsproteinet viste friske blader (figur 1C), som viste omfattende protein ekspresjon i henhold grønt lys (fig. 1D). Utvinning av de totale løselige proteiner ble utført på tobakksplanter som hadde blader som inneholdt det forbigående uttrykte TrCel5A pr…

Discussion

Rekombinant ekspresjon av cellulaser er et felt av stor interesse, på grunn av ønsket om mer effektive biobrensel produksjonssystemer ^en. Planter gir mange muligheter for vellykket cellulase produksjon, med funksjoner som økonomisk høsting teknikker og autohydrolysis metoder blir svært ønskelige egenskaper for storskala produksjon av biodrivstoff. Videre, bruk av forskjellige lokaliseringer for å produsere proteiner som tillater, hvis nødvendig, posttranslational modifikasjoner ^20. Endre pl…

Materials

4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside	SIGMA-ALDRICH	M6018
Acetic acid	ROTH	3738
Acetosyringon (concentrated)	ROTH	6003
Antibiotic – kanamycin	ROTH	T832
Antibiotic – rifampicin	ROTH	4163
Antibiotic – carbenicillin	ROTH	6344
Antibody – rabbit anti His(6) pAb	ROCKLAND	600-401-382
Antibody – goat anti rabbit AP, FC pAb	DIANOVA	111-055-008
Azo-carboxymethyl cellulose	MEGAZYME	S-ACMC
β-cyclodextrin	SIGMA-ALDRICH	C4805
Calcium chloride dihydrate	SIGMA-ALDRICH	C5080
Carboxymethyl cellulose	ROTH	3333.1
Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921	SIGMA-ALDRICH	C2730
Congo red	SIGMA-ALDRICH	75768
Coomasie brilliant blue G 250	ROTH	9598.2
D(+)-glucose	ROTH	8337
Ethanol	ROTH	K928
Filter paper – Rotilabo blotting paper	ROTH	CL67
NBT/BCIP	SIGMA-ALDRICH	72091
MES buffer	ROTH	4256
Methanol	ROTH	8388
Sodium citrate	ROTH	3580
Sodium dodecylsulfate	SERVA	20765
Sodium hydroxide	ROTH	6771
Soil, Einheitserde classic	PATZER GMBH
Spectrometer – Infinite M200	TECAN
Sucrose	SIGMA-ALDRICH	S-5390
4-Hydroxy benzhydrazide	SIGMA-ALDRICH	H9882
Phosphate buffered saline	ROTH	1058
UV light source – BLAK RAY	UVP
Vibratome – VT1000S	Leica