Экспрессия рекомбинантных Целлюлаза Cel5A от<em> Trichoderma reesei</em> В растениях табака
Summary
Растения табака были использованы для получения грибковые целлюлазы, TrCel5A, через систему переходных экспрессии. Выражение может контролироваться с использованием флуоресцентного слитый белок и белок активность характеризовалась после выражение.
Abstract
Целлюлоза разрушающие ферменты, целлюлозы, являются объектами как исследований, так и промышленных интересов. Преобладание этих ферментов в трудных для культуры организмов, таких как гифы потенциала грибков и анаэробных бактерий, поспешил использование рекомбинантных технологий в этой области. Методы выражения завод являются желательным система для крупномасштабного производства ферментов и других промышленно полезных белков. При этом способы временной экспрессии грибковых эндоглюканазы, Trichoderma reesei Cel5A, в Nicotiana аЬасит демонстрируются. Выражение Успешное белок показано, контролируется флуоресценции с использованием гибридного белка mCherry-фермента. Кроме того, набор базовых тестов используются для изучения деятельности временно выраженной Т. reesei Cel5A, в том числе в ДСН-ПААГ, Вестерн-блоттинга, зимографии, а также флуоресценции и на основе красителя подложки деградации анализов. Система, описанная здесь, могут использоваться для получения активной ячейкиÜlase в течение короткого периода времени, с тем, чтобы оценить потенциал для дальнейшего производства в растениях через учредительных или индуцибельных систем экспрессии.
Introduction
Деградация лигноцеллюлозной биомассы и ее преобразования в жидкое топливо было предусмотрено в качестве метода для уменьшения зависимости от ископаемых видов топлива. Одним из важных препятствием в установлении экономически обоснованных систем обработки биомассы в ферментативного расщепления целлюлозы и гемицеллюлозы 1. Системы экспрессии растений показывают большой потенциал для производства ферментов в промышленном масштабе. Сельскохозяйственные системы для сбора растений экономически и в объеме уже установлены, так как они были в течение тысяч лет. Производство целлюлаз в растениях желательно из-за таких факторов, как легкость автогидролиза 2, и потенциал для максимального использования более низких уровнях ферментов, увеличивая усвояемость клеточных стенок растений 1. Наконец, системы растений позволяют адресности рекомбинантных белков в конкретных областях растительных клеток и способны посттрансляционно изменить ферменты, где необходимые 3.
ve_content ">Nicotiana аЬасит (табак) очень широко используется в качестве модельного организма для гетерологичными исследований экспрессии белка в растениях, в связи с его быстрым ростом и биомассы особенностей накопления 4. Переходный экспрессии рекомбинантных белков является метод, который позволяет производство белка в короткие периоды времени 5, при сохранении гибкости в отношении локализации и, таким образом посттрансляционной модификации выбранных белков, т.е. целлюлазы. Это позволяет производить целлюлазы (ы) для базового анализа, в то же время заложить основу для дальнейших стратегий экспрессии в растениях. Использование такого переходную стратегию экспрессии, эндоглюканазы из гликозилгидролаз семейства 5, Cel5A, полученного из грибка Trichoderma reesei хоста (Hypocrea jecorina) 6 производится (далее по тексту TrCel5A). TrCel5A является 42 кДа белок, который изначально гликозилирован и очень активен в гидравлическиеroylzing целлюлозных цепей 7.
Методика переменной экспрессии описано здесь, основаны на сравнительно обычно используемой системе, проникают листьев растений с Agrobacteria, несущий ген интереса в соответствующий вектор экспрессии. Для обеспечения быстрого анализа успеха в выражении Планта, TrCel5A также может быть выражено в виде слитого белка с mCherry, мономерного флуоресцентного белка первоначально полученных от Discosoma зр. Белок DsRed 8, с дополнительными шестью остатками гистидина (His-тегов), слитых с С-конец (TrCel5A-mCherry). Экспрессия гетерологичного слитого белка, TrCel5A-mCherry, таким образом, может контролироваться в рамках растущего растения с помощью зеленый свет для изучения mCherry разгон. При желании тонкие слои растительного материала может быть рассмотрен в зеленом свете под микроскопом, чтобы установить конкретную локализацию белка. За эту работу сигнала и переходовсидят пептиды были включены в конструкцию, чтобы локализовать гетерологичный экспорт белка в эндоплазматический ретикулум 9.
Чтобы проанализировать деятельность растений, выраженных целлюлазы, в том числе TrCel5A, ряд тестов активность целлюлазы может быть запущен. После экстракции от общего растворимых белков растений, TrCel5A может быть частично очищен с использованием метода термической инкубации. Белок размер устанавливается с помощью SDS-PAGE с последующим вестерн-блоттинга. Зимографии могут быть использованы для анализа активностью в отношении субстратов, например целлюлозы который был карбокси-метилированный (изготовление карбоксиметилцеллюлозу: CMC) на растворимость 10. Целлюлазы и глюкозидазы можно контролировать с помощью флуорофора 4-метилумбеллиферил (4-MU), связанное с β-D-целлобиозида (комбинированный: 4-MUC). Другой метод для оценки эндоглюканазы деятельность включает в себя спектрометрический анализ CMC который был связан с азо-двы (Remazolbrilliant Голубой R) 11. Кроме того, белок активность обоих эндоглюканаз и ряд целлюлазы можно контролировать с помощью теста на анализ сахара, такие как гидразида р-гидрокси бензойной кислоты (PAHBAH) анализа 12. Эти методы могут быть использованы для выяснения и количественной оценки активности экспрессированного целлюлазы, представляющего интерес.
Protocol
Representative Results
Discussion
Рекомбинантной экспрессии целлюлазы является полем большой интерес, в связи с желанием более эффективных систем производства биотоплива 1. Растения предлагают много возможностей для успешного производства целлюлазы, с такими функциями, как методы экономического уборки и метод…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана БМБФ Forschungsinitiative "Bioenergie 2021 – Forschung für умереть Nutzung фон BIOMASSE" и кластера к совершенству "Персонализированные сделал топлива из биомассы», который финансируется в рамках инициативы совершенства немецкими федерального правительства и правительств, чтобы содействовать развитию науки и исследования в немецких университетах.
Materials
| 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| Acetic acid | ROTH | 3738 | |
| Acetosyringon (concentrated) | ROTH | 6003 | |
| Antibiotic – kanamycin | ROTH | T832 | |
| Antibiotic – rifampicin | ROTH | 4163 | |
| Antibiotic – carbenicillin | ROTH | 6344 | |
| Antibody – rabbit anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| Antibody – goat anti rabbit AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-cyclodextrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| Congo red | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie brilliant blue G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-glucose | ROTH | 8337 | |
| Ethanol | ROTH | K928 | |
| Filter paper – Rotilabo blotting paper | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| Methanol | ROTH | 8388 | |
| Sodium citrate | ROTH | 3580 | |
| Sodium dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
| Sodium hydroxide | ROTH | 6771 | |
| Soil, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| Spectrometer – Infinite M200 | TECAN | ||
| Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| Phosphate buffered saline | ROTH | 1058 | |
| UV light source – BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome – VT1000S | Leica |
Riferimenti
- Garvey, M., Klose, H., Fischer, R., Lambertz, C., Commandeur, U. Cellulases for biomass degradation: comparing recombinant cellulase expression platforms. Trends in Biotechnology. 31, 581-593 (2013).
- Klose, H., Günl, M., Usadel, B., Fischer, R., Commandeur, U. Ethanol inducible expression of a mesophilic cellulase avoids adverse effects on plant development. Biotechnology for Biofuels. 6, 53 (2013).
- Klose, H., Röder, J., Girfoglio, M., Fischer, R., Commandeur, U. Hyperthermophilic endoglucanase for in planta lignocellulose conversion. Biotechnology for Biofuels. 5, 63 (2012).
- Sharma, A. K., Sharma, M. K. Plants as bioreactors: recent developments and emerging opportunities. Biotechnology Advances. 27 (6), 811-832 (2009).
- Tremblay, R., Wang, D., Jevnikar, A. M., Ma, S. Tobacco, a highly efficient green bioreactor for production of therapeutic proteins. Biotechnology Advances. 28 (2), 214-221 (2010).
- Lee, T. M., Farrow, M. F., Arnold, F. H., Mayo, S. L. A structural study of Hypocrea jecorina Cel5A. Protein Science. 20, 1935-1940 (2011).
- Saloheimo, M., et al. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene. 63, 11-21 (1988).
- Davidson, M. W., Campbell, R. E. Engineered fluorescent proteins: innovations and applications. Nature Methods. 6, 713-717 (2009).
- Pelham, H. R. The retention signal for soluble proteins of the endoplasmic reticulum. Trends in Biochemical Sciences. 15, 483-486 (1990).
- Béguin, P. Detection of cellulase activity in polyacrylamide gels using Congo red-stained agar replicas. Analytical Biochemistry. 131, 333-336 (1983).
- Jørgensen, H., Mørkeberg, A., Krogh, K. B. R., Olsson, L. Growth and enzyme production by three Penicillium species on monosaccharides. Journal of Biotechnology. 109, 295-299 (2004).
- Lever, M. A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Analytical Biochemistry. 47, 273-279 (1972).
- Maclean, J., et al. Optimization of human papillomavirus type 16 (HPV-16) L1 expression in plants: comparison of the suitability of different HPV-16 L1 gene variants and different cell-compartment localization. Journal of General Virology. 88, 1460-1469 (2007).
- Munro, S., Pelham, H. R. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. Cell. 48, 899-907 (1987).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Burnette, W. N. “Western Blotting”: Electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112, 195-203 (1981).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Elelctrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets – procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
- Blake, M. S., Johnston, K. H., Russell-Jones, G. J., Gotschlich, E. C. A rapid, sensitive method for detection of alkaline phosphatase-conjugated anti-antibody on Western blots. Analytical Biochemistry. 136, 175-179 (1984).
- Yamamoto, E., Yamaguchi, S., Nagamune, T. Effect of β-cyclodextrin on the renaturation of enzymes after sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis. Analytical Biochemistry. 381, 273-275 (2008).
- Fischer, R., Vaquero-Martin, C., Sack, M., Drossard, J., Emans, N., Commandeur, U. Towards molecular farming in the future: transient protein expression in plants. Biotechnology and Applied Biochemistry. 30 (2), 113-116 (1999).
- Sammond, D. W., et al. Cellulase linkers are optimized based on domain type and function: Insights from sequence analysis, biophysical measurements, and molecular simulation. PLoS One. 7, (2012).
- Boonvitthya, N., Bozonnet, S., Burapatana, V., O’Donohue, M. J., Chulalaksananukul, W. Comparison of the heterologous expression of Trichoderma reesei endoglucanase II and cellobiohydrolase II in the yeasts Pichia pastoris and Yarrowia lipolytica. Molecular Biotechnology. 54, 158-169 (2013).
