Trypanosomes에서 RNA 편집에 대한 마약 검사에 대한 기자로 RNA 촉매
Summary
A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.
Abstract
실질적인 진전은 trypanosomes에있는 미토콘드리아 RNA 편집의 메커니즘을 결정을했다. 마찬가지로, 상당한 진전은 RNA 편집을 촉매 editosome 착체의 구성 요소를 식별하는 제되었다. 그러나, 그 단백질이 함께 작동하는 방법을 아직 분명하지 않다. editosome 대하여 높은 처리량 스크린에서 얻어진 화합물은 편집주기에서 하나 이상의 단계를 차단하거나 영향을 미칠 수있다. 따라서, 새로운 화합물의 확인은 editosome 기능과 어셈블리를 해부에 대한 가치있는 분자 프로브를 생성합니다. 이전 연구에서, 시험 관내 편집 분석법은 무선 – 표지 된 RNA를 사용하여 수행 하였다. 이러한 분석은 시간에 비효율적이고 높은 처리량의 목적에 적합하지, 소모적이다. 여기서, 균일 한 형광 기반의 "혼합 측정"RNA 편집을 모니터링하는 망치 리보 자임 체외 기자의 분석을 제시한다. 만의 RNA 편집의 결과로해머 헤드 리보 자임 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 올리고 리보 뉴클레오타이드 기판 분열을 거친다. 이것은 차례로하여 신호를 생성하는 형광 소광로부터의 분리를 초래한다. editosome 기능이 저해되는 경우 반대로, 형광 신호가 급냉 될 것이다. 이 체외 RNA 편집 또는 editosome 기능을 억제 할 수있는 화학 물질의 높은 처리량 검사에 모니터에 일반적으로 적용되어야 매우 민감하고 간단한 분석이다.
Introduction
RNA 편집, mRNA의 전사 후 개질 공정은, 제 1 trypanosomatids에서 발견되었다. 그 이후로, 실질적인 작업은 Trypanosoma brucei 2,3에서 RNA 편집의 뒤에 기계를 연구 실시하고있다. 일련의 효소 반응에서 editosome 약 20 단백질의 코어 복합체는, 에너지 발생 산화 적 인산화 시스템의 여러 구성 요소를위한 성숙한 미토콘드리아의 mRNA를 생성한다. 촉매 이벤트의 순서는 가이드 RNA를 (gRNAs)에 의해 결정으로, endonucleolytic 분열, 우리 딜 (U) 추가 또는 삭제, 결찰입니다 4.
코어 editosome 복잡한 단백질 외에도 소품 요인도 5-7을 확인되었다. 이 단백질은 주로 독립적 인 단지로 분류 볼 수 있습니다. 그러나, 코어 editosome 복잡 단백질 어셈블리의 순서와 소품과 코어 복합체의 상호 작용 패턴착물은 아직 결정되지하다. trypanosomatids에서 RNA 편집 과정을 대상으로하는 화학 dissectors를 제공 할 수 있다는 editosome 복합체의 조립 및 기능을 공부에 도움. 또한, 여러 editosome 단백질의 기능 연구는 약 8 ~ 12을 대상으로 자신의 잠재력을 나타내는 다른 생활 단계에 걸쳐 요점을 보여 주었다. 따라서 editosome의 발견 억제제도 trypanosomatids 대하여 리드 화합물로서 작용할 수있다. trypanosomatid으로 인한 질병에 대한 현재 사용 가능한 약물, 독성이 비효율적이고 비용이 13, 14로이시의 적절하다.
효율적이고 편리한 시험 관내 분석은 RNA 편집을 차단 특정 억제제 화학 우주를 탐구 할 필요가있다. 세 가지 분석법이 개발 editosome 활동을 모니터링하는 데 사용되었다 : 시험 관내 RNA 편집 세이 15 (a) 전체 라운드, (b) 시험 관내 RNA 편집 분석 16,17에 미리 절단ND (C) 망치 리보 자임 (HHR) 분석 18 기반. 처음 두 개의 분석 실험은 방사능의 도움으로 편집 된 제품 (ATPase의 6의 mRNA)의 직접 시각화에 의존하고 있습니다. HHR 기반 분석은 편집시 리보 자임로 동작하는 모델로 ATPase의 6의 mRNA의 수정 된 버전을 사용합니다. 기능 리보 자임은 특히 기자로서, 방사성 동위 원소 표지 된 RNA 기판을 절단한다. 최근 Moshiri는 외. 개발 '혼합 측정'방사성 표지 된 RNA 기판은 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 기판 (19)으로 교체되는 경우 RNA 편집을 모니터하기 위해 시험 관내 리포터 분석에서 HHR 기반한다. 이 분석의 원리 장점이 있습니다 : (A)는 활성 리보 자임 및 기판 절단의 생산이 낮은 볼륨 (즉, 20 μL)에서 동일한 관에서 동시에 발생하는, 신속하고 편리한 믹스와 분석의 측정 유형입니다, (B )는 방사성 표지 된 물질의 사용을 피하고, (c) 감도 즉이다형광 마이크로 타이 터 플레이트 포맷으로 계측하고, (d) 노이즈 비율이 높은 신호에 의해 fforded. 이 분석을 이용하여, 정제 된 editosome 대하여 공지 RNA 편집 리가 아제 억제제의 효과 (19)를 확인 하였다. 이 실험은 주로 T.에서 전체 editosomes에 대해, RNA 편집 억제제의 신속한 식별을 위해 분석을 확인 brucei.
도 1의 상세한 단계별 개략적 인 형광 계 관내 RNA 편집 분석에서. 이 프로토콜은 두 시험 관내에서 RNA 편집을 모니터링하거나 쉽게 다양한 스케일의 화합물 라이브러리를 스크리닝 적응 될 위해 사용될 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trypanosomes의 RNA 편집 복잡한에 대한 억제제를 식별하는 새로운 높은 처리량 검사 방법은 trypanosomatids으로 인한 질병에 대응하기 위해 약물 발견을위한 새로운 도구를 제공하고, 제시했다. FRET 기반 리보 자임 분석은 광범위하게 다양한 용도 20-22에 사용되었다; 그러나, 우리는 RNA 편집 활동 (19)의 생체 모니터링을위한 FRET 기반 리보 자임의 분석의 능력을 활용했다. 이 분석은…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najmeh Nikpour and Fiona Alum provided suggestions and edited this manuscript. Department of Biochemistry at McGill University supported HM and VM with the CIHR Training Initiative in Chemical Biology. This work was supported by Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (to R. S.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SDM-79 Medium | Gibco by life technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | life technologies | 12483-020 | heat inactivation at 550C for 1 h |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2ML | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19: 1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1Kg | life technologies | AM9902 |
Riferimenti
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