RNA Catalyst som reporter for Screening narkotika mot RNA Redigering i trypanosomer
Summary
A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.
Abstract
Betydelige framskritt er gjort i å bestemme mekanismen av mitokondrie RNA redigering i trypanosomer. På samme måte har betydelige fremskritt blitt gjort for å identifisere komponentene i editosome kompleks som katalyserer RNA-redigering. Men det er fortsatt ikke klart hvordan disse proteinene fungerer sammen. Kjemiske forbindelser oppnådd fra en high-throughput-skjermen mot editosome kan blokkere eller påvirke en eller flere av trinnene i redigerings syklus. Derfor vil identifisering av nye kjemiske forbindelser generere verdifulle molekylære prober for dissekere editosome funksjon og montering. I tidligere studier, ble in vitro-redigering assays utføres ved hjelp av radiomerket RNA. Disse analysene er tidkrevende, ineffektiv og uegnet for høy gjennomstrømming formål. Her, en homogen fluorescens-basert "mikse og måle" hammer Ribozyme in vitro reporter analysen for å overvåke RNA redigering, blir presentert. Bare som en konsekvens av RNA-redigering avhammer Ribozyme en fluorescens resonans energioverføring (FRET) oligoribonucleotide underlaget gjennomgår cleavage. Dette i sin tur resulterer i separasjon av fluoroforen fra slukkeren derved å gi et signal. I kontrast, når editosome funksjon inhiberes, fluorescens-signalet vil bli slukket. Dette er en meget følsom og enkel metode som bør være generelt anvendbar for å overvåke in vitro RNA-redigering eller high throughput screening av kjemikalier som kan hemme editosome funksjon.
Introduction
Prosessen med RNA redigering, en post-transcriptional mRNA modifikasjon, ble først oppdaget i trypanosomatids en. Siden da har betydelig arbeid utført i å studere mekanismen bak RNA redigering i Trypanosoma brucei 2,3. I en serie av enzymatiske reaksjoner, den editosome, en kjerne kompleks på omtrent 20 proteiner, skaper modne mitokondrielle mRNA for flere komponenter av energigenerer oksidativ fosforylering system. Rekkefølgen av katalytiske hendelser er endonucleolytic cleavage, uridylate (U) tillegg eller sletting, og ligering, som diktert av guide RNA (gRNAs) 4.
I tillegg til kjerne editosome komplekse proteiner, har en rekke tilbehørs faktorer også blitt identifisert 5-7. Disse proteinene er mest sett gruppert i uavhengige komplekser. Imidlertid er rekkefølgen av protein sammenstillingen i kjernen editosome kompleks og interaksjons mønstre av kjernen kompleks med tilbehøretkomplekser er ennå ikke bestemt. Targeting RNA redigeringsprosessen i trypanosomatids kan gi kjemiske dissectors som hjelpemiddel i å studere montering og funksjon av editosome kompleks. Videre har funksjonelle studier på flere editosome proteiner vist essentiality tvers av ulike livsstadier, indikerer deres potensial som stoffet mål 8-12. Derfor kan de funnet hemmere av editosome også fungere som blyforbindelser mot trypanosomatids. Dette er riktig, da legemidler for tiden tilgjengelig mot sykdommer forårsaket av trypanosomatid er giftige, ineffektiv og kostbar 13,14.
En effektiv og praktisk in vitro-analysen er nødvendig å undersøke den kjemiske universet for spesifikke hemmere som blokkerer RNA redigering. Tre analyser har blitt utviklet og brukt til å overvåke editosome aktiviteter: (a) hel runde in vitro RNA-redigering assay 15, (b) pre-spaltet in vitro RNA-redigering assay 16,17, etnd (c) hammer Ribozyme (HHR)-baserte analysen 18. De første to tester er avhengige direkte visualisering av de redigerte produkt (ATPase 6 mRNA) ved hjelp av radioaktivitet. Den HHR-baserte analysen benytter en modifisert versjon av ATPase 6 mRNA som er modellert til å oppføre seg som et ribozym ved redigering. Den funksjonelle ribozym deretter spesifikt spalter en radiomerket RNA-substrat, som fungerer som en reporter. Nylig Moshiri et al. Utviklet en 'blande og måle' HHR basert in vitro reporter assay for å overvåke RNA-redigering, hvor den radioaktivt merkede RNA-substratet er blitt erstattet med et fluorescens-resonans energioverføring (FRET) substrat 19.. De viktigste fordelene med denne analysen er: (a) det er en hurtig og enkel blanding og måle type assay, som produksjon av aktivt ribozym og substrat spaltning inntreffer samtidig i det samme rør i lavt volum (dvs. 20 ul), (b ) den unngår anvendelse av radioaktivt merket materiale, (c) sensitivitet som er enfforded av fluorescens instrumentering i et mikro-titer plateformat, og (d) et høyt signal-til-støy-forhold. Ved hjelp av denne analysen, ble effekten av kjente RNA redigering ligase hemmere mot renset editosome bekreftet 19. Dette forsøk bekreftet at analysen for rask identifisering av RNA-redigering inhibitorer, først og fremst mot hele editosomes fra T. brucei.
Figur 1 viser et detaljert trinn-for-trinn skjematisk av fluorescens-basert in vitro RNA-redigering assay. Denne protokollen kan brukes enten til å overvåke RNA redigering in vitro eller lett tilpasses for screening sammensatte biblioteker av ulike skalaer.
Protocol
Representative Results
Discussion
En roman high-throughput screening metode for å identifisere hemmere mot RNA redigering kompleks av trypanosomer ble presentert, og gir et nytt verktøy for medisiner for å motvirke sykdommer forårsaket av trypanosomatids. FRET-baserte Ribozyme analysen har vært mye brukt til ulike formål 20-22; Imidlertid, har vi benyttet kapasiteten FRET-assay basert ribozym for in vitro-overvåkning av RNA-redigering aktivitet 19. Denne assay kan potensielt være tilpasset andre typer RNA-redigerin…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najmeh Nikpour and Fiona Alum provided suggestions and edited this manuscript. Department of Biochemistry at McGill University supported HM and VM with the CIHR Training Initiative in Chemical Biology. This work was supported by Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (to R. S.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SDM-79 Medium | Gibco by life technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | life technologies | 12483-020 | heat inactivation at 550C for 1 h |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2ML | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19: 1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1Kg | life technologies | AM9902 |
Riferimenti
- Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
- Hajduk, S., Ochsenreiter, T. RNA editing in kinetoplastids. RNA biology. 7, 229-236 (2010).
- Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).
- Seiwert, S. D., Stuart, K. RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro. Science. 266, 114-117 (1994).
- Weng, J., et al. Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids. Molecular. 32, 198-209 (2008).
- Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex. RNA. 14, 970-980 (2008).
- Ammerman, M. L., et al. Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1. Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).
- Huang, C. E., O’Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein. Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).
- Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes. Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).
- Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).
- Schnaufer, A., et al. An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Science. 291, 2159-2162 (2001).
- Tarun, S. Z., et al. KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei. RNA. 14, 347-358 (2008).
- Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends in parasitology. 21, 508-512 (2005).
- Denise, H., Barrett, M. P. Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness. Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).
- Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84, 831-841 (1996).
- Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing. Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).
- Igo, R. P., et al. Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing. Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).
- Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing. RNA. 8, 548-554 (2002).
- Moshiri, H., Salavati, R. A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens. Nucleic Acids Res. 38, e138 (2010).
- Jenne, A., et al. Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology. Nature. 19, 56-61 (2001).
- Hartig, J. S., et al. Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time. Nature. 20, 717-722 (2002).
- Famulok, M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).
- Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein. Science. 260, 1816-1819 (1993).
- Jurica, M. S. Searching for a wrench to throw into the splicing machine. Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).
- Spahn, C., Prescott, C. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus. Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).
