RNA-katalysator som en reporter för screening droger mot RNA Redigera i trypanosomer
Summary
A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.
Abstract
Betydande framsteg har gjorts för att bestämma mekanismen för mitokondriell RNA redigering i trypanosomer. På liknande sätt har betydande framsteg gjorts för att identifiera komponenterna i editosome komplexet som katalyserar RNA-redigering. Det är emellertid fortfarande oklart hur dessa proteiner fungerar tillsammans. Kemiska föreningar, erhållen från en hög genomströmning skärm mot editosome kan blockera eller påverka ett eller flera steg i redigeringscykeln. Därför kommer identifieringen av nya kemiska föreningar generera värdefulla molekylära sonder för att dissekera editosome funktion och montering. I tidigare studier har in vitro-redigering analyser utförs med hjälp av radioaktivt märkt RNA. Dessa analyser är tidsödande, ineffektiv och olämplig för high-throughput ändamål. Här, en homogen fluorescens-baserade "blanda och mät" reporter hammarhuvudribozym in vitro-analys för att övervaka RNA redigering, presenteras. Endast som en konsekvens av RNA-redigering avden hammarhuvudribozym en fluorescensresonansenergiöverföring (FRET) oligoribonukleotid substrat genomgår klyvning. Detta i sin tur resulterar i separation av fluoroforen från utsläckaren därigenom producera en signal. När däremot den editosome funktion hämmas, den fluorescenssignal kommer att släckas. Det här är en mycket känslig och enkel analys som ska vara tillämplig för övervakning in vitro-RNA-redigering eller hög throughput screening av kemikalier som kan hämma editosome funktionen.
Introduction
Processen för RNA-redigering, en post-transkription mRNA modifikation, upptäcktes först i trypanosomatids 1. Sedan dess har ett omfattande arbete genomförts för att studera mekanismen bakom RNA-redigering i Trypanosoma brucei 2,3. I en serie av enzymatiska reaktioner, den editosome, en kärna komplex av cirka 20 proteiner skapar mogna mitokondriella mRNA för flera komponenter i den energialstrande oxidativ fosforylering systemet. Ordningen på katalytiska händelser är endonukleolytisk klyvning, uridylat (U) tillägg eller strykningar, och ligation, som dikteras av styr RNA (gRNAs) 4.
Utöver kärn editosome komplexa proteiner, har en rad tillbehör faktorer också identifierats 5-7. Dessa proteiner är oftast ses grupperade i fristående komplex. Men ordningen på proteinaggregat i kärn editosome komplexa och interaktionsmönster kärn komplex med tillbehöretkomplexen är ännu inte fastställts. Inriktning RNA redigeringsprocessen i trypanosomatids kan ge kemiska dissectors att stöd i att studera montering och funktion editosome komplexet. Dessutom har funktionella studier på flera editosome proteiner visat essentialitet i olika livsstadier, vilket indikerar deras potential som läkemedelsmål 8-12. Därför kan de funna inhibitorer av editosome också fungera som blyföreningar mot trypanosomatids. Det här är rätt tid, eftersom läkemedel som för närvarande finns tillgängliga mot sjukdomar orsakade av trypanosomatid är giftiga, ineffektiva och dyra 13,14.
En effektiv och bekväm in vitro-analys är nödvändig för att undersöka den kemiska universum för specifika hämmare som blockerar RNA-redigering. Tre analyser har utvecklats och använts för att övervaka editosome aktiviteter: (a) fullständig runda i RNA redigering vitro 15, (b) i förväg klyvs i RNA redigering vitro 16,17, ennd (c) hammarhuvudribozym (HHR)-baserad analys 18. De första två analyser förlitar sig på direkt visualisering av den redigerade produkt (ATPas-6 mRNA) med hjälp av radioaktivitet. Den HHR-baserad analys använder en modifierad version av ATPas 6 mRNA som modelleras för att bete sig som en ribozym vid redigering. Den funktionella ribozym då specifikt klyver en radiomärkt RNA-substrat, som fungerar som en reporter. Nyligen Moshiri et al. Utvecklat en "blanda och mät" HHR-baserad i reporter vitro-analys för att övervaka RNA-redigering där den radiomärkta RNA-substrat är ersatt med en fluorescensresonansenergiöverföring (FRET)-substratet 19. De huvudsakliga fördelarna med denna analys är följande: (a) det är ett snabbt och bekvämt blanda och mät typ av analys, som produktion av aktiv ribozym-och substratklyvning uppträda samtidigt i samma rör i låg volym (dvs 20 ul), (b ) den undviker användningen av radioaktivt märkta material, (c)-känslighet som är enfforded genom fluorescens instrumentering i en mikro-titer plattformat och (d) ett högt signal-brusförhållande. Med hjälp av denna analys, var effekten av kända RNA-redigering ligas hämmare mot renat editosome bekräftad 19. Detta experiment validerade analysen för snabb identifiering av RNA-redigering-hämmare, framför allt mot hela editosomes från T. brucei.
Figur 1 är en detaljerad steg-för-steg-schema av fluorescensbaserad i RNA redigering vitro analys. Detta protokoll kan antingen användas för övervakning av RNA-redigering in vitro eller enkelt anpassas för screening av substansbibliotek av olika skalor.
Protocol
Representative Results
Discussion
En ny high-throughput screening metod för att identifiera inhibitorer mot RNA redigering komplex av trypanosomer presenterades, vilket ger ett nytt verktyg för läkemedelsutveckling för att motverka sjukdomar orsakade av trypanosomatids. FRET-baserade ribozym analys har använts i stor utsträckning för olika ändamål från 20 till 22; dock har vi använt kapacitet FRET-baserade ribozym analys för in vitro övervakning av RNA-redigering aktivitet 19. Denna analys skulle kunna anpassa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najmeh Nikpour and Fiona Alum provided suggestions and edited this manuscript. Department of Biochemistry at McGill University supported HM and VM with the CIHR Training Initiative in Chemical Biology. This work was supported by Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (to R. S.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SDM-79 Medium | Gibco by life technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | life technologies | 12483-020 | heat inactivation at 550C for 1 h |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2ML | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19: 1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1Kg | life technologies | AM9902 |
Riferimenti
- Benne, R., et al. transcript of the frameshifted coxII gene from trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell. 46, 819-826 (1986).
- Hajduk, S., Ochsenreiter, T. RNA editing in kinetoplastids. RNA biology. 7, 229-236 (2010).
- Aphasizhev, R., Aphasizheva, I. Uridine insertion/deletion editing in trypanosomes: a playground for RNA-guided information transfer. Wiley interdisciplinary reviews RNA. 2, 669-685 (2011).
- Seiwert, S. D., Stuart, K. RNA editing: transfer of genetic information from gRNA to precursor mRNA in vitro. Science. 266, 114-117 (1994).
- Weng, J., et al. Guide RNA-binding complex from mitochondria of trypanosomatids. Molecular. 32, 198-209 (2008).
- Hashimi, H., Zikova, A., Panigrahi, A. K., Stuart, K. D., Lukes, J. TbRGG1, an essential protein involved in kinetoplastid RNA metabolism that is associated with a novel multiprotein complex. RNA. 14, 970-980 (2008).
- Ammerman, M. L., et al. Architecture of the trypanosome RNA editing accessory complex, MRB1. Nucleic Acids Res. 40, 5637-5650 (2012).
- Huang, C. E., O’Hearn, S. F., Sollner-Webb, B. Assembly and function of the RNA editing complex in Trypanosoma brucei requires band III protein. Molecular and cellular biology. 22, 3194-3203 (2002).
- Carnes, J., Trotter, J. R., Peltan, A., Fleck, M., Stuart, K. RNA editing in Trypanosoma brucei requires three different editosomes. Molecular and cellular biology. 28, 122-130 (2008).
- Hearn, S. F., Huang, C. E., Hemann, M., Zhelonkina, A., Sollner-Webb, B. Trypanosoma brucei RNA editing complex: band II is structurally critical and maintains band V ligase, which is nonessential. Molecular and cellular biology. 23, 7909-7919 (2003).
- Schnaufer, A., et al. An RNA ligase essential for RNA editing and survival of the bloodstream form of Trypanosoma brucei. Science. 291, 2159-2162 (2001).
- Tarun, S. Z., et al. KREPA6 is an RNA-binding protein essential for editosome integrity and survival of Trypanosoma brucei. RNA. 14, 347-358 (2008).
- Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends in parasitology. 21, 508-512 (2005).
- Denise, H., Barrett, M. P. Uptake and mode of action of drugs used against sleeping sickness. Biochemical pharmacology. 61, 1-5 (2001).
- Seiwert, S. D., Heidmann, S., Stuart, K. Direct visualization of uridylate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell. 84, 831-841 (1996).
- Igo, R. P., Palazzo, S. S., Burgess, M. L., Panigrahi, A. K., Stuart, K. Uridylate addition and RNA ligation contribute to the specificity of kinetoplastid insertion RNA editing. Molecular and cellular biology. 20, 8447-8457 (2000).
- Igo, R. P., et al. Role of uridylate-specific exoribonuclease activity in Trypanosoma brucei RNA editing. Eukaryotic cell. 1, 112-118 (2002).
- Wang, B., Salavati, R., Heidmann, S., Stuart, K. A hammerhead ribozyme substrate and reporter for in vitro kinetoplastid RNA editing. RNA. 8, 548-554 (2002).
- Moshiri, H., Salavati, R. A fluorescence-based reporter substrate for monitoring RNA editing in trypanosomatid pathogens. Nucleic Acids Res. 38, e138 (2010).
- Jenne, A., et al. Rapid identification and characterization of hammerhead-ribozyme inhibitors using fluorescence-based technology. Nature. 19, 56-61 (2001).
- Hartig, J. S., et al. Protein-dependent ribozymes report molecular interactions in real time. Nature. 20, 717-722 (2002).
- Famulok, M. Allosteric aptamers and aptazymes as probes for screening approaches. Current opinion in molecular therapeutics. 7, 137-143 (2005).
- Teng, B., Burant, C. F., Davidson, N. O. Molecular cloning of an apolipoprotein B messenger RNA editing protein. Science. 260, 1816-1819 (1993).
- Jurica, M. S. Searching for a wrench to throw into the splicing machine. Nature chemical biology. 4, 3-6 (2008).
- Spahn, C., Prescott, C. Throwing a spanner in the works: antibiotics and the translation apparatus. Journal of molecular medicine. 74, 423-439 (1996).
