Matriz de hibridación genómica comparada (CGH array) para la detección de número de copias genómicas variantes
Summary
CGH array para la detección de variantes de número de copias genómicas ha reemplazado análisis de cariotipo de bandas-G. Este artículo describe la tecnología y su aplicación en un laboratorio de servicio de diagnóstico.
Abstract
Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient’s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.
Introduction
Se ha sabido durante muchos años que las supresiones o copias extra de segmentos cromosómicos provocan discapacidad intelectual, dismorfia y malformaciones congentical, y en algunos casos causar síndromes genéticos 1. Sin embargo, la única tecnología disponible hasta mediados de la década de 2000 para la detección de todo el genoma de estos cambios fue G-bandas cromosoma análisis, que tiene una resolución de alrededor de 5-10 MB, dependiendo de la región y la naturaleza de los desequilibrios, y que no puede detectar cromosomas anormales donde el material ha sido reemplazado por una región de un cromosoma diferente con el mismo patrón de bandas. Técnicas citogenéticas auxiliares tales como la hibridación fluorescente in situ y la sonda de amplificación ligadura específica multiplex han estado disponibles durante el interrogatorio de loci específicos, en los casos de sospecha de desequilibrio sindrómico específico, pero no fue hasta la introducción de la gama de hibridación genómica comparada (CGH array) en s de diagnóstico clínico de rutinaervicio 2-5 que la detección de todo el genoma de las variantes de número de copias (CNV) se hizo posible en un gran aumento de resolución (por lo general alrededor de 120kb). Trabajos de servicio clínico junto estudios de investigación han demostrado que la CNV para algunas regiones se han generalizado en la población normal 6-7, mientras que otro CNV, previamente indetectables, están asociados con neurodisabilities como el autismo y la epilepsia 8-11.
El protocolo descrito en este documento se utiliza en nuestro laboratorio de diagnóstico clínico UK National Health Service (NHS); utilizamos estrategias de hibridación novela, ensayo de lotes y la robótica para minimizar el costo de este servicio financiado por el estado.
Antes de el protocolo detallado a continuación, el ADN de alta calidad debe ser extraído del material de partida apropiado, comúnmente sangre, células cultivadas o muestras de tejido. Espectrofotometría se puede utilizar para medir la concentración (debe ser> 50 ng / ul) y comprobar 260: 280 razón de absorbancia (b debee 1,8-2,0). La electroforesis en gel se puede utilizar para verificar que el ADN es de alto peso molecular sin degradación significativa.
Este protocolo está diseñado para los laboratorios de mayor rendimiento que está etiquetando 96 muestras por corrida utilizando la robótica de manipulación de líquidos automatizados. Sin embargo, puede ser adaptado para laboratorios de rendimiento inferiores sin automatización.
Protocol
Representative Results
Discussion
Array CGH no detectará reordenamientos balanceados o anormalidades ploidía como triploidía. Además, los desequilibrios de mosaico de bajo nivel no se pueden detectar. Sin embargo, array CGH tiene una mayor resolución para la detección de la CNV de análisis cromosómico bandas-G del cual ha sustituido en muchos laboratorios de citogenética. Por lo tanto, es el actual estándar de oro para la detección de la CNV en todo el genoma. Puede ser reemplazado por las tecnologías de secuenciación de próxima generació…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| CGH microarray 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array CGH wash buffers | Agilent | 5188-5226 | |
| Array CGH hybridisation buffer | Agilent | 5188-5380 | |
| Minelute purification kit | Qiagen | 28006 | |
| Array CGH labelling kit | Enzo | ENZ-42672-0000 |
Riferimenti
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