Array jämförande genomik hybridisering (Array CGH) för detektion av genomiska Copy Number Variants
Summary
Array CGH för detektion av genomiska kopietal varianter har ersatt G-banded karyotyp analys. Detta dokument beskriver tekniken och dess tillämpning i en diagnostisk tjänst laboratorium.
Abstract
Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its application in a clinical diagnostic service laboratory. DNA extracted from a patient’s sample (blood, saliva or other tissue types) is labeled with a fluorochrome (either cyanine 5 or cyanine 3). A reference DNA sample is labeled with the opposite fluorochrome. There follows a cleanup step to remove unincorporated nucleotides before the labeled DNAs are mixed and resuspended in a hybridization buffer and applied to an array comprising ~60,000 oligonucleotide probes from loci across the genome, with high probe density in clinically important areas. Following hybridization, the arrays are washed, then scanned and the resulting images are analyzed to measure the red and green fluorescence for each probe. Software is used to assess the quality of each probe measurement, calculate the ratio of red to green fluorescence and detect potential copy number variants.
Introduction
Det har varit känt i många år att strykningar eller extra kopior av kromosomsegment orsakar utvecklingsstörning, dysmorphism och congentical missbildningar, och i vissa fall orsaka genetiska syndrom en. Men den enda teknik som finns tillgänglig fram till mitten av 2000-talet för genomet hela detektion av dessa förändringar var G-banded kromosomanalys, som har en upplösning på omkring 5-10Mb, beroende på region och typ av obalans, och som inte kan upptäcka onormala kromosomer där materialet har ersatts av en region från en annan kromosom med samma bandmönster. Underordnade cytogenetiska tekniker såsom fluorescens in situ hybridisering och multiplex ligation specifik sond förstärkning har varit tillgängliga för förhör av specifika loci, vid misstanke specifika syndrom obalans, men det var inte förrän införandet av arrayen jämförande genomisk hybridisering (array CGH) in i rutinmässig klinisk diagnostisk sERVICE 2-5 som genomet hela detektering av antal kopior varianter (CNVs) blev möjligt på en kraftigt ökad upplösning (vanligtvis runt 120 KB). Klinisk servicearbete vid sidan forskningsstudier har visat att CNVs för vissa regioner är utbredd i normalbefolkningen 6-7, medan andra CNVs, tidigare påvisas, är förknippade med neurodisabilities som autism och epilepsi 8-11.
Det protokoll som beskrivs i detta dokument används i vår brittiska National Health Service (NHS) klinisk diagnoslaboratorium; Vi använder nya hybridiseringsförfaranden strategier, partiprovning och robotar för att minimera kostnaderna i detta statligt finansierad service.
Före det protokoll som beskrivs nedan, bör högkvalitativt DNA extraheras från det lämpliga utgångsmaterialet, vanligen blod, odlade celler eller vävnadsprover. Spektrofotometri kan användas för att mäta koncentrationen (bör vara> 50 ng / ul) och kontrollera 260: 280 absorbansenheter förhållanden (skulle be 1,8-2,0). Gelelektrofores kan användas för att kontrollera att DNA är av hög molekylvikt utan betydande nedbrytning.
Detta protokoll är utformad för högre genomströmning laboratorier som märkning 96 prover per körning med hjälp av automatiserade robotvätskehanterings. Det kan emellertid vara anpassade för lägre genomströmning labb utan automation.
Protocol
Representative Results
Discussion
Array CGH kommer inte upptäcka balanserade rearrangemang eller ploidi störningar såsom triploidy. Vidare kan mosaik obalanser låg nivå inte upptäckas. Dock har array CGH en högre upplösning för CNV detektion än G-banded kromosomanalys som det har ersatt i många cytogenetik laboratorier. Det är därför den nuvarande standarden för genomet hela CNV upptäckt. Den kan ersättas av nästa generations sekvenseringsteknologier i framtiden, men för närvarande, deras kostnader och de tekniska svårigheterna i sa…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have no acknowledgements.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| CGH microarray 8 x 60K | Agilent | G4126 | |
| Array CGH wash buffers | Agilent | 5188-5226 | |
| Array CGH hybridisation buffer | Agilent | 5188-5380 | |
| Minelute purification kit | Qiagen | 28006 | |
| Array CGH labelling kit | Enzo | ENZ-42672-0000 |
Riferimenti
- Miller, D. T., et al. Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies. Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).
- Ahn, J. W., et al. Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals – results from four years’ clinical application for over 8,700 patients. Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).
- Ahn, J. W., et al. Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance. Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).
- Beaudet, A. L. The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics. Child Dev. 84, 121-132 (2013).
- Park, S. J., et al. Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases. Mol. Cytogenet. 4, 12 (2011).
- Iafrate, A. J., et al. Detection of large-scale variation in the human genome. Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).
- Redon, R., et al. Global variation in copy number in the human genome. Nature. 444, 444-454 (2006).
- Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome. Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).
- Molin, A. M., et al. A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features. J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).
- Tropeano, M., et al. Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders. PLoS One. 8, e61365 (2013).
- Bon, B. W., et al. Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome. J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).
