Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.
Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.
SNF2 complexes chromatine de la famille de remodelage comprennent une sous-unité ATPase central SNF2 comme 1,2. Certaines fonctions des ATPases SNF2 comme les enzymes de sous-unités simples, tandis que d'autres fonctionnent comme la sous-unité catalytique de grands complexes multi-sous-unités. Élucider les mécanismes moléculaires par lesquels chacune des sous-unités de complexes de remodelage de la chromatine contribuent à leurs activités nécessite la capacité à effectuer des dosages biochimiques qui dissèquent le processus de remodelage.
ATP-dépendante des nucléosomes remodelage par le complexe INO80 humain et d'autres enzymes de remodelage de la chromatine peut être envisagé comme un processus en plusieurs étapes qui commence par la liaison du remodelage enzyme de nucléosomes, suivie de l'activation de son ADN et / ou des nucléosomes dépendante ATPase, la translocation de l'enzyme sur l'ADN nucléosomique remodelage, et éventuel repositionnement des nucléosomes 1,2. La compréhension des détails moléculaires de l'ATP-dépendante processus de remodelage de la chromatine récessite dissection de la réaction de remodelage en ses différentes étapes de définition et des contributions des sous-unités individuelles du complexe de remodelage de chromatine à chaque étape de la réaction. Ces analyses nécessitent la capacité d'analyser le remodelage du nucléosome et autres activités utilisant des substrats moléculaires définies in vitro.
Dans un protocole de JOVE précédente, nous avons décrit les procédures utilisées pour générer des complexes et Subcomplexes de remodelage INO80 avec des compositions de sous-unités définies 3. Ici, nous présentons trois dosages biochimiques qui permettent une analyse quantitative de la liaison, l'ADN et nucléosome activé ATPase, et les activités de remodelage du nucléosome associés à ces complexes nucléosome.
Afin de s'assurer que nucléosome remodelage et activités ATPase on observe dans des dosages dépendent de l'activité catalytique des complexes de INO80, et non sur contaminant rénovation et / ou d'enzymes ATPase, nous nucléosome régulièrement dosage remodelage et l'activité ATPase de versions catalytiquement inactives de complexes INO80, purifié dans parallèle avec le type sauvage INO80 utilisant la même procédure. Une réaction témoin négatif dépourvu ATP doit également être effectué l…
The authors have nothing to disclose.
Work in the authors’ laboratory is supported by a grant from the National Institute of General Medical Sciences (GM41628) and by a grant to the Stowers Institute for Medical Research from the Helen Nelson Medical Research Fund at the Greater Kansas City Community Foundation.
Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | P8340 | |
10x PCR reaction buffer | Roche Applied Science | 11435094001 | |
Roche Taq DNA Polymerase | Roche Applied Science | 11435094001 | |
NucAway Nuclease-free Spin Columns | Ambion | Cat. # AM10070 | |
ultrapure ATP | USB/Affymetrix | 77241 25 UM | |
bovine serum albumin | Sigma | A9418 | |
N,N,N´,N´-tetramethylethylenediamine (TEMED) | Thermo Scientific | 17919 | Fisher Scientific |
40% Acrylamide/Bis 37.5:1 | Amresco | 0254-500ML | |
Sonicated salmon sperm DNAs | GE Healthcare | 27-4565-01 | |
10% ammonium persulfate (APS) | Thermo Scientific | 17874 | |
benzonase | Novagen | Cat. No. 70664 | |
[α-32P] ATP (3000 Ci/mmol) | PerkinElmer | BLU003H250UC | |
dCTP, [α-32P]- 6000Ci/mmol | PerkinElmer | BLU013Z250UC | |
Equipment | Company | ||
PCR thermal cycler PTC 200 | MJ Research | PTC 200 | |
Hoefer vertical electrophoresis unit | Hoefer | SE600X-15-1.5 | |
lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes | Costar | 3207 | |
Storage Phosphor Screen | Molecular Dynamics | 63-0034-79 | |
3MM filter paper | Whatman | 28458-005 | VWR |
Typhoon PhosphorImager | GE Healthcare | 8600 | |
ImageQuant software | GE Healthcare | ver2003.02 | |
TLC Glass Plates, PEI-Cellulose F | Millipore | 5725-7 | |
Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4 | Millipore | IPFL07810 | |
General purpose survey meter with end-window or pancake GM (Geiger-Mueller) probe | Biodex | Model 14C |