Den tredimensionella kultur metod som beskrivs i detta protokoll rekapitulerar bukspottkörteln utveckling från spridda embryonala mus bukspottkörteln progenitorceller, inklusive deras betydande expansion, differentiering och morfogenes i ett grenat orgel. Denna metod är mottaglig för bildbehandling, funktionella störningar och manipulation av nisch.
The pancreas is an essential organ that regulates glucose homeostasis and secretes digestive enzymes. Research on pancreas embryogenesis has led to the development of protocols to produce pancreatic cells from stem cells 1. The whole embryonic organ can be cultured at multiple stages of development 2-4. These culture methods have been useful to test drugs and to image developmental processes. However the expansion of the organ is very limited and morphogenesis is not faithfully recapitulated since the organ flattens.
We propose three-dimensional (3D) culture conditions that enable the efficient expansion of dissociated mouse embryonic pancreatic progenitors. By manipulating the composition of the culture medium it is possible to generate either hollow spheres, mainly composed of pancreatic progenitors expanding in their initial state, or, complex organoids which progress to more mature expanding progenitors and differentiate into endocrine, acinar and ductal cells and which spontaneously self-organize to resemble the embryonic pancreas.
We show here that the in vitro process recapitulates many aspects of natural pancreas development. This culture system is suitable to investigate how cells cooperate to form an organ by reducing its initial complexity to few progenitors. It is a model that reproduces the 3D architecture of the pancreas and that is therefore useful to study morphogenesis, including polarization of epithelial structures and branching. It is also appropriate to assess the response to mechanical cues of the niche such as stiffness and the effects on cell´s tensegrity.
Organkultur ger en användbar modell som överbryggar klyftorna mellan den komplexa men mycket relevant in vivo-undersökningar och bekvämt men ungefärlig simulering av cellinje modeller. I fallet med bukspottkörteln, det inte finns någon cell linje perfekt motsvarar pankreas progenitorer även om det är transformerade cellinjer som simulerar endokrina och exokrina celler. Den vuxna Hela bukspottkörteln kan inte odlas; isolerade endokrina cellöar kan upprätthållas under några få veckor, utan att celltillväxt och vävnadsskivor kan hållas in vitro under några timmar 5. Embryonala bukspottkörteln kultur har använts i stor utsträckning inte bara för att studera dess utveckling, men också för att undersöka epitelceller-mesenkymala interaktioner 4,6,7, att bilden processer 8 eller kemiskt störa dem 9. Två organodlingsmetoder används främst: den första består i att odla pankreas knoppar på fibronektin belagda plattor 2, vilket är convenient för avbildningsändamål; det andra alternativet är att odla organ på filter på luft-vätske-gränssnittet 3,4 som bäst bevarar morfogenes. Även mycket användbara, är dessa metoder leder till en viss grad av tillplattning; expansionen av progenitorceller är mycket begränsad i jämförelse med den normala utvecklingen och utgångspopulationen är komplex innefattande alla typer av pankreatiska celler och mesenkymala celler.
Förmågan att kulturen och expandera spridda primära celler är värdefullt att studera härstamning relationer och avslöja de inneboende egenskaper isolerade celltyper 10. Sugiyama m.fl. 11. Skulle kunna behålla pankreas stamceller och endokrina stamfäder som behållit vissa funktionella tecken i 3-5 dagar i kultur på matarskikt. Pancreatospheres, besläktad med neurosfärer 12 och mammospheres 13, har utökats från vuxna cellöar och duktala celler även om vilken typ av progenitorer / stamcellersom genererar dessa sfärer är inte klart. Dessutom, i motsats till fysiologisk utveckling innehöll pancreatospheres vissa nervceller 14,15. Klot har också nyligen producerat från embryonala pankreasgångare 16,17 och regenere pancreata 18 med god stamfader expansion och efterföljande differentiering men misslyckades med att rekapitulera morfogenes.
3D-modeller från spridda och ofta definierade celler som själv organiserar i miniatyriserade organ har nyligen blomstrade och simulera utvecklingen eller en vuxen omsättning på flera organ såsom tarm 19,20, magen 21, lever 22, prostata 23 och luftstrupen 24. I vissa fall har utvecklings morfogenes och differentiering valts rekapituleras i 3D från ES-celler, såsom är fallet med optiska kopparna 25, tarmen 26 eller hjärn 27.
Här, vi desCribe en metod att expandera dissocierade multi pankreas stamceller i en 3D Matrigel byggnadsställning där de kan differentiera och självorganisation.
Storskalig produktion av funktionella betaceller in vitro är fortfarande ineffektivt 1. I detta utmanande sammanhang, kan utvecklingsbiologiska studier hjälpa dechiffrera de exakta signaler som krävs för differentiering av funktionella betaceller. Detta protokoll möjliggör för underhåll, utbyggnad och differentiering av embryonala pankreas stamceller in vitro. Detta omfattar bildandet av insulinproducerande betaceller som inte samar uttrycka andra endokrina hormoner, har höga nivåe…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats sekventiellt av en NCCR Frontiers i genetik pilot utmärkelse, Juvenile Diabetes Research Foundation Grant 41-2009-775 och Grant 12-126875 från Det Frie Forskningsråd / Sundhed og Sygdom. Författarna tackar Spagnoli labbet för värd för videoinspelning.
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock keept at -20°C | |
KnockOut Serum replacement (supplement) | Gibco | 10828-028 | Stock keept at -20°C | |
2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | 3148-25ML | Stock keept at 4°C | |
Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Calbiotech | 524400-1MG | Stock keept at -20°C | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems | |
EGF | Sigma Aldrich | E9644-2MG | Stock keept at -80°C | |
Recombinant Human R-spondin 1 | R&D | 4645-RS-025/CF | Stock keept at -80°C | |
- or - | ||||
Recombinant Mouse R-spondin 1 | R&D | 3474-RS-050 | Stock keept at -80°C | |
Recombinant Human FGF1 (aFGF) | R&D | 232-FA-025 | Stock keept at -80°C- do not include to increase beta cell production | |
Heparin (Liquemin) | Drossapharm | Stock keept at 4°C | ||
Recombinant Human FGF10 | R&D | 345-FG-025 | Stock keept at -80°C | |
DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | ||
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15070-063 | Stock keept at -20°C | |
B27 x50 (supplement) | Gibco | 17504-044 | Stock keept at -20°C | |
Recombinant Human FGF2 (bFGF) | R&D | 233-FB-025 | Stock keept at -80°C | |
Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | Stock keept at -20°C- Attention! Stability/source is a frequent source of problems | |
DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | ||
Matrigel | Corning | 356231 | Stock keept at -20°C | |
Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | Stock keept at 4°C | |
RNAlater – RNA stabilizing reagent | Qiagen | 76104 | Store at room temperature | |
Dispase | Sigma Aldrich | D4818-2MG | Stock keept at -20°C | |
BSA for reconstitution | Milipore | 81-068 | For reconstituition of cytokines – Stock keept at -20°C | |
Fetal calf serum (FCS) | Gibco | 16141079 | Stock keept at -20°C | |
60 well MicroWell trays | Sigma Aldrich | M0815-100EA | ||
4-well plates | Thermo Scientific | 176740 | ||
95-well plates F bottom | Greiner Bio | 6555180 | ||
Glas bottom plates | Ibidi | 81158 | ||
Disposal micropittes | Blaubrand | 708745 |