Protokoll för Biofilm Streamer Bildning i ett mikroflödessystem enhet med Micro-stolparna
Summary
Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.
Abstract
Flera bakteriearter har förmågan att fästa vid ytor och kolonisera dem i form av tunna filmer som kallas biofilm. Biofilmer som växer i porösa medier är relevanta för flera industriella och miljömässiga processer såsom avloppsrening och CO2 kvarstad. Vi använde Pseudomonas fluorescens, en gramnegativ aerob bakterie, för att undersöka biofilm bildning i en mikroflödessystem enhet som härmar porösa medier. Den mikrofluidanordning består av en matris av mikro inlägg, som tillverkades med användning av mjuk-litografi. Därefter var biofilmbildning i dessa enheter med flödes utreds och vi demonstrerar bildandet av trådformiga biofilmer som kallas serpentiner i vår enhet. De detaljerade protokoll för tillverkning och montering av mikroflödessystem enhet finns här tillsammans med bakteriekulturen protokollen. Detaljerade förfaranden för experiment med mikroflödessystem enhet presenteras också tillsammans med företrädareresultat.
Introduction
Nyligen visade vi bakteriella biofilm bildningsdynamik i ett mikroflödessystem enhet som efterliknar porösa medier 1. Bakteriella biofilmer är i huvudsak kolonier av ytan aggregerade bakterier som är inneslutna av extracellulära polymera substanser (EPS) 2-4. Dessa tunna filmer av bakterier kan bildas i nästan alla tänkbara nisch allt från släta ytor till mycket mer komplex livsmiljö porösa medier. Et al. Valiei 1 använde en mikrofluidanordning med en matris av mikropelare för att simulera ett poröst mediestruktur och studerade biofilmbildning i denna anordning som en funktion av fluidflödeshastighet. De fann att i en viss ordning flöde, fintrådiga biofilmer kallas serpentiner började växa fram mellan olika pelare. Streamer kan tjudras vid en eller båda ändarna till fasta ytor, men resten av strukturen suspenderas i vätskan. Streamer formation börjar vanligtvis efter en inledande lager av biofilm har bildats och dess formation kan diktera den långsiktiga utvecklingen av biofilm i sådana komplexa livsmiljöer. Nyligen har flera forskare undersökt dynamiken i streamer bildning. Et al. Yazdi 5 visade att serpentiner kan bildas i Virvelflödena med ursprung från en oscillerande bubblan. I ett annat experiment al. Rusconi et 6 undersökte effekten av kanal krökning och kanalgeometri på bildandet av streamers. De fann att de serpentiner kan bildas i krökta sektioner av mikrokanaler, och streamer morfologi är relaterad till motilitet. Ny forskning har visat att streamers kan ha breda återverkningar i olika naturliga och konstgjorda scenarion eftersom de kan fungera som föregångare till bildandet av mogna strukturer i porösa gränssnitt, leder till snabb och katastrofal biofilm spridning inom biomedicinska system, och även orsaka betydande flödes struktur interaktioner osv 1,7-9.
Biofilm streamers bildar ofta jagn komplexa livsmiljöer såsom porösa medier. Förståelse biofilm tillväxt i porösa medier miljö är relevant för flera miljömässiga och industriella processer som biologisk vattenrening 10, upprätthålla väl borrhålet integritet i situationer som CO2 avskiljning 11 och pluggning av porer i marken 12. Observation biofilmsbildning i sådana komplexa miljöer kan ofta vara en utmaning på grund av opaciteten för porösa medier. I sådana situationer kan mikrofluidik baserade porösa medierna visa sig vara mycket fördelaktigt eftersom de möjliggör realtid och övervaka situ. En annan fördel med mikrofluidik är förmågan att bygga flera bioreaktorer på en bio-mikroflödes plattform och samtidigt göra det möjligt för online-övervakning och / eller infogandet av sensorer. Flexibiliteten att genomföra flera laboratorieexperiment i en enhet och möjlighet att samla in betydande relevanta uppgifter för noggrann statistisk analys är en viktig advantage av mikroflödessystem 13,14.
Inom ramen för ovanstående diskussion skulle förståelse streamer bildningsdynamik i ett poröst mediemiljö vara fördelaktig för flera tillämpningar. I denna studie utvecklar vi protokollet för utredning streamer bildning i en enhet som härmar porösa medier. Tillverkning av mikroflödes plattformen, är nödvändiga åtgärder för cellodling och experiment som beskrivs. I våra experiment, var vildtyp bakteriell stam av Pseudomonas fluorescens användes. P. fluorescens, som finns naturligt i marken, spelar en viktig roll för att upprätthålla markens ekologi 15. Den bakteriestam användes hade manipulerats genetiskt för att uttrycka grönfluorescerande protein (GFP) konstitutivt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi visade en enkel mikroflödessystem enhet som efterliknar porösa medier för att studera biofilm utveckling i komplexa miljöer. Det finns flera viktiga steg som dikterar resultatet av experimenten. De inkluderar anordningen geometri. Medan efter geometri kan variera, är nödvändigt tillräckligt por-utrymme för streamers att bilda. Dessutom Valiei et al. 1 har visat att streamer bildning förekommer endast i en viss flödeshastighet intervall. Vid flödeshastigheter lägre än ett tröskelvär…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Professor Howard Ceri from the Biological Sciences Department of the University of Calgary for providing bacterial strains. A. Kumar acknowledges support from NSERC. T. Thundat acknowledges financial support from the Canada Excellence Research Chair (CERC) program. The authors would also like to acknowledge help from Ms. Zahra Nikakhtari for help with videography.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flourescent Microscope | Nikon | ||
| LB agar | Fisher | BP1425-500 | suspend 40 g in 1 L of purified water |
| LB broth | Fisher | BP1427-500 | suspend 20 g in 1 L of purified water |
| Biosafety hood | Microzone corporation | ||
| Petri-dish | Fisher | 875712 | sterile 100mmx15mm polystyrene petri dish |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24incubator shaker series | |
| 50 mL sterilized centrifuge tube | Corning | 430828 | Polypropylene Rnase-/Dnase-free |
| Tetracycline free base | MP Biomedicals | 103012 | 50 ug/mL |
| SYLGARD 184 silicone | Dow Corning Corporation | 68037-59-2 | Elastomer Base and curing agent |
| Positive photoresist (AZ4620) | |||
| Plastic tube | Cole- Parmer |
Riferimenti
- Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).
- Costerton, J. W. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).
- Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. All together now: Integrating biofilm research across disciplines. MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).
- Yazdi, S., Ardekani, A. M. Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow. Biomicrofluidics. 6, 044114 (2012).
- Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers. J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).
- Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems. P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).
- Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems. Biofouling. 28, 551-562 (2012).
- Taherzadeh, D., et al. Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows. Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).
- Vrouwenvelder, J. S., et al. Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems. Water Res. 44, 689-702 (2010).
- Mitchell, A. C., et al. Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2. International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).
- Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. Modeling of biological clogging in unsaturated porous media. J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).
- Kumar, A., et al. Microscale confinement features can affect biofilm formation. Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).
- Neethirajan, S., et al., Bhushan, B., et al. . Encylopedia of Nanotechnology. , (2012).
- Barathi, S., Vasudevan, N. Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil. Environ Int. 26, 413-416 (2001).
- Das, S., Kumar, A. Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets. arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).
- Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Phys Rev Lett. 93, (2004).
- Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications. Lab Chip. 8, 689-693 (2008).
