Protocolo para Biofilm Streamer Formación en un dispositivo de microfluidos con Micro-pilares
Summary
Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.
Abstract
Varias especies bacterianas poseen la capacidad de adherirse a las superficies y colonizar ellos en la forma de películas delgadas llamadas biopelículas. Las biopelículas que crecen en medios porosos son relevantes para varios procesos industriales y ambientales, tales como el tratamiento de aguas residuales y secuestro de CO 2. Utilizamos Pseudomonas fluorescens, una bacteria aerobia gram-negativos, para investigar la formación de biopelículas en un dispositivo de microfluidos que imita medios porosos. El dispositivo microfluídico consiste de una matriz de micro-mensajes, que fueron fabricados utilizando litografía suave. Posteriormente, la formación de biopelículas en estos dispositivos con flujo fue investigado y se demuestra la formación de biofilms filamentosos conocidos como serpentinas en nuestro dispositivo. Los protocolos detallados para la fabricación y montaje de dispositivo de microfluidos se proporcionan aquí junto con los protocolos de cultivo bacteriano. Los procedimientos detallados para la experimentación con el dispositivo de microfluidos también se presentan junto con el representanteresultados.
Introduction
Recientemente, hemos demostrado la dinámica de la formación de biopelículas bacterianas en un dispositivo de microfluidos que imita medios porosos 1. Los biofilms bacterianos son esencialmente colonias de bacterias de la superficie agregada que están cubiertos de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) 2-4. Estas películas delgadas de bacterias pueden formar en casi todos los nichos concebible que van desde superficies lisas para el hábitat mucho más complejo de los medios porosos. Valiei et al. 1 utiliza un dispositivo de microfluidos con una matriz de micro-pilares para simular una estructura de medios porosos y estudió la formación de biopelículas en este dispositivo como una función de la tasa de flujo de fluido. Encontraron que en un régimen de flujo determinado, biofilms filamentosos conocidos como serpentinas comenzaron a surgir entre los diferentes pilares. Serpentinas pueden ser atados en uno o ambos extremos para superficies sólidas, pero el resto de la estructura se suspende en un líquido. Formación Streamer comienza típicamente después de una capa inicial de la biopelícula se ha formado y su formatoion puede dictar la evolución a largo plazo de la biopelícula en tales hábitats complejos. Recientemente, varios investigadores han estudiado la dinámica de formación de serpentina. Yazdi et al. 5 mostró que las serpentinas pueden formar en los flujos de torbellino se originan en una burbuja oscilante. En otro experimento, Rusconi et al. 6 investigó el efecto de la curvatura del canal y la geometría del canal en la formación de serpentinas. Ellos encontraron que las serpentinas se pueden formar en secciones curvas de microcanales, y la morfología streamer está relacionada con la motilidad. La investigación reciente ha demostrado que las cuerdas pueden tener una amplia repercusión en diversos escenarios naturales y artificiales, ya que pueden actuar como precursores para la formación de estructuras porosas maduros en las interfaces, conducir a la proliferación de biopelículas rápido y catastrófico en unos sistemas biomédicos, y también puede causar Flow sustancial interacciones estructura, etc 1,7-9.
Serpentinas Biofilm menudo forman in hábitats complejos como medios porosos. El crecimiento de biopelículas Entendimiento en el entorno de medios porosos es relevante para varios procesos industriales y medioambientales como el tratamiento biológico de aguas residuales 10, manteniendo así la integridad de ánima en situaciones como la captura de CO2 11 y el taponamiento de los poros en el suelo 12. Observar la formación de biopelículas en tales hábitats complejos, con frecuencia puede ser un reto debido a la opacidad de medios porosos. En tales situaciones, las plataformas de medios porosos microfluidos basada pueden resultar muy ventajosa, ya que permiten en tiempo real y el seguimiento in situ. Otra ventaja de la microfluídica es la capacidad de construir múltiples biorreactores en una sola plataforma de microfluidos bio-y simultáneamente permitir la supervisión y / o incorporación de sensores en línea. La flexibilidad para implementar múltiples experimentos de laboratorio en un solo dispositivo y la capacidad de recopilar datos pertinentes importantes para el análisis estadístico exacto es un adv importanteantage de los sistemas de microfluidos 13,14.
En el contexto de la discusión anterior, la comprensión de la dinámica de formación de serpentina en un entorno de medios porosos sería beneficioso para varias aplicaciones. En este estudio, desarrollamos el protocolo para la investigación de la formación de serpentina en un dispositivo que imita los medios porosos. La fabricación de la plataforma de microfluidos, se describen los pasos necesarios para el cultivo celular y la experimentación. En nuestros experimentos, se empleó la cepa bacteriana de tipo salvaje de Pseudomonas fluorescens. P. fluorescens, que se encuentra naturalmente en el suelo, juega un papel clave en el mantenimiento de la ecología del suelo 15. La cepa bacteriana empleada había sido manipulada genéticamente para expresar la proteína fluorescente verde (GFP) constitutivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos demostrado un dispositivo de microfluidos sencillo que imita medios porosos para estudiar el desarrollo del biofilm en hábitats complejos. Hay varios pasos críticos que determinan el resultado de los experimentos. Ellos incluyen geometría del dispositivo. Mientras que la geometría mensaje puede variar, adecuada poro-espacio para serpentinas para formar es necesario. Además, Valiei et al. 1 han demostrado que la formación de streamer se produce sólo en un cierto rango de caudal. A caudale…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Professor Howard Ceri from the Biological Sciences Department of the University of Calgary for providing bacterial strains. A. Kumar acknowledges support from NSERC. T. Thundat acknowledges financial support from the Canada Excellence Research Chair (CERC) program. The authors would also like to acknowledge help from Ms. Zahra Nikakhtari for help with videography.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Flourescent Microscope | Nikon | ||
| LB agar | Fisher | BP1425-500 | suspend 40 g in 1 L of purified water |
| LB broth | Fisher | BP1427-500 | suspend 20 g in 1 L of purified water |
| Biosafety hood | Microzone corporation | ||
| Petri-dish | Fisher | 875712 | sterile 100mmx15mm polystyrene petri dish |
| Incubator shaker | New Brunswick Scientific | Excella E24incubator shaker series | |
| 50 mL sterilized centrifuge tube | Corning | 430828 | Polypropylene Rnase-/Dnase-free |
| Tetracycline free base | MP Biomedicals | 103012 | 50 ug/mL |
| SYLGARD 184 silicone | Dow Corning Corporation | 68037-59-2 | Elastomer Base and curing agent |
| Positive photoresist (AZ4620) | |||
| Plastic tube | Cole- Parmer |
Riferimenti
- Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device. Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).
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