Kapsulær Serotypning af<em> Streptococcus pneumoniae</em> Af latexagglutinering

Summary

Latexagglutinationstest test er en enkel, hurtig og billig metode til serotypning Streptococcus pneumoniae, og har også været almindeligt anvendt i diagnostisk mikrobiologi. Dette håndskrift beskriver in-house produktion af latexagglutinering reagenser, procedurer for kvalitetskontrol, og anvendelsen af ​​denne teknik til pneumokok serotypning.

Abstract

Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the ‘gold standard’ Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective.

This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.

Introduction

Streptococcus pneumoniae (pneumokok) er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed i børn under fem år på verdensplan, især i ressourcefattige indstillinger ^1,2. Pneumokoksygdom spænder fra lokaliserede infektioner til livstruende tilstande, såsom lungebetændelse, sepsis og meningitis ^1,2.

Mere end 90 serotyper af pneumokokker er blevet identificeret ud fra forskelle i deres kapselpolysaccharid ^3. Aktuelle vacciner målrette kapselpolysaccharidet og yde beskyttelse mod de store serotyper, der forårsager invasiv sygdom ^4. Serotypning pneumokokisolater er vigtig for at vurdere virkningen af vaccination mod transport og sygdom samt give bredere epidemiologiske oplysninger ^5,6. Den nuværende "gyldne standard" metode til pneumokok serotypning er Quellung test, men det er tidskrævende og kræver en vis færdighed at Perform ^7. Latexagglutinering er en alternativ serotypning, der anbefales af WHO ^7. Latexagglutinering er hurtig og enkel at udføre, og er ansat i mange laboratorier verden over ^8-11. Vigtigere er det, har latexagglutinering vist sammenlignelig nøjagtighed til Quellung testen for pneumokok serotypning ^10,12-14. Samlet set er denne metode er ideel til ressourcesvage indstillinger samt høj kapacitet laboratorier.

Latexagglutinering reagenser ("latex reagenser ') er skabt af binding af antistoffer til latexpartikler ^15. Ved en positiv reaktion, disse mærkede partikler agglutinere i nærvær af antigen. Kommercielle latexreagenserne er til rådighed for et begrænset udvalg af serotyper. Latex reagenser kan også fremstilles i huset ved hjælp af kommercielt tilgængelige antisera ^10. Blandinger af antisera ("pools"), samt specifikke antisera til pneumokok serogroups (fx gruppe 19), individuelle serotyper (f.eks serotype 5) og til specifikke antigener (»faktorer«, f.eks. faktor 19c anerkende serotype 19A) for yderligere at definere serotyper inden for grupper er tilgængelige ^16.

Dette håndskrift skitserer de vigtigste trin i produktionen af ​​latexreagenserne bruger passive fastgørelse af kommercielt tilgængelige antisera til latex partikler. De kvalitetskontrol (QC) aspekter af denne metode er beskrevet, samt en protokol for brug af latex reagenser til pneumokok serotypning er inkluderet.

Protocol

1. Fremstilling af in-house latexreagenserne Fremstilling af glycin saltvand (GBS) Tilføj 1,5 g glycin, 11,7 g natriumchlorid og 100 ml destilleret vand til en 200 ml bægerglas. Bland at opløse anvendelse af en magnetisk omrører. Overfør blandingen til en 500 ml måleglas og tilsæt destilleret vand for at lave i alt 200 ml. Opløsningen overføres tilbage til 200 ml bægerglas kontrollere pH og juster til 8,2 med 5 M natriumhydroxid. BEMÆRK: Natriumhydroxid er ætsende, bære personlige værnemidler. Filtersteriliser opløsningen ved hjælp af 0,22 um filtre og flere 60 ml sprøjter i en 250 ml preautoclaved skruelåg glasflaske. Opbevar ved stuetemperatur. Fremstilling af GBS med 0,2% bovint serumalbumin Tilsæt 0,2 g bovint serumalbumin (BSA) i pulverform og 100 ml GBS til en 200 ml bægerglas og blandes for at opløse ved hjælp af en magnetisk omrører. Filtersterilisere opløsningen gennem 0,22 um filtre ved hjælp af flere 60 ml sprøjter i en 250 ml preautoclaved skruelåg glasflaske. Opbevares ved 4 ° C. Latexreagens forberedelse Mærke et 2 ml rundbundet mikrofugerør. BEMÆRK: rundbundede rør anvendes til at minimere partikelsedimenteringskammer, som kan påvirke antistof vedhæftet fil. Ved hjælp af en P1000 pipette med sterile spidser tilføje 975 ul GBS i mikrofugerøret, hvorefter der tilsættes 25 ul passende pneumokok antiserum til latexreagens forberedes (dvs. pool, gruppe, type eller faktor). Invert fem gange for at blande. Fortyndet polystyrenlatexpartikler 1:10 ved tilsætning af 120 pi af latexpartikler til 1.080 pi sterilt fysiologisk saltvand. BEMÆRK: Dette kan gøres i større mængder, men bør gøres frisk hver gang latexreagenserne produceres. Tilføj 1000 pi 1:10 latexsuspension (fremstillet i trin 1.3.3) til 1,000 pi 1:40 antiserum suspension (fremstillet i trin 1.3.2). Invert fem gange for at blande. Der inkuberes ved 37 ° C på en langsomt roterende hjul (fx 4 rpm i et hjul 38,5 cm diameter) i 2 timer. Centrifugeres i 15 minutter ved 1.100 x g. Supernatanten fjernes, og forsigtigt pellet resuspenderes i 2 ml sterilt saltvand. Centrifugeres i 15 minutter ved 1.100 x g. Supernatanten fjernes, og der tilsættes 1 ml GBS og forsigtigt pellet resuspenderes. Pipette latexsuspensionen i en mærket 5 ml skruelåg rør. Tilføj yderligere 1 ml af GBS. Tilsæt 2 ml GBS indeholdende 0,2% BSA (w / v) (pH 8,2) (fremstillet i trin 1.2). Tilsæt 40 ​​gl 10% (w / v) opløsning af natriumazid som konserveringsmiddel. BEMÆRK: Natriumazid er farligt, hvis det indåndes, og er en hud og øjenirriterende. Det er ønskeligt at købe en forberedt 10% opløsning i stedet for pulverform, da dette minimerer risikoen for eksponering ved indånding. Personlige værnemidler (herunder handsker end beskyttelsesbriller) bør anvendes ved håndtering af dette reagens. Der henvises til sikkerhedsdatabladet for detaljer. Store latexreagenserne ved 4 ° C. Fremstilling af den negative kontrol latexreagens Mærke et 2 ml rundbundet mikrofugerør. BEMÆRK: rundbundede rør anvendes til at minimere partikelsedimenteringskammer, som kan påvirke antistof vedhæftet fil. Ved hjælp af en P1000 pipette med sterile spidser tilføje 975 ul GBS i mikrofugerøret, tilsæt derefter 25 ul normal kanin antiserum. Invert fem gange for at blande. Fortsæt som i trin 1.3.3 til 1.3.10 ovenfor 2. Kvalitetskontrol (QC) i latexreagenserne Bring latexreagens til RT. Umiddelbart før brug, bland forsigtigt den latexreagens ved at vende røret flere gange. Tjek reagens til autoagglutination ved pipettering 15 pi på et objektglas og fortsætte som i trin 4.7 og 4.8 nedenfor. Der bør ikke være engglutination af latexpartiklerne. Reagenset skal vises hvid og glat. Test reagenset mod et panel af lav passage pneumokokisolater. Der benyttes frisk dyrkes kulturer fremstillet som i trin 3. Panelet isolater bør omfatte isolater af 'target' serotype (den specifikke serotyper for reagenset bliver testet) og »ikke-mål 'serotyper (isolater af andre serotyper, der normalt ikke skal krydse reagere med reagenset). Omfatter mindst ét ​​isolat af hvert mål og ikke-mål serotype for hver latexreagens gennemgår QC. Hvis der kun er ét mål eller ikke-mål-serotype, test to forskellige isolater af den pågældende serotype. BEMÆRK: testpanelet bør omfatte flere isolater af hver serotype, hvoraf nogle er usædvanligt i invasiv sygdom og / eller Type Culture samlinger. Det er at foretrække at medtage nogle transport-isolater, da de ofte er mere krævende at serotype (data ikke vist), hvilket yderligere teste kapaciteten of reagenserne og sikre, at reagenserne er sandsynligvis i stand til serotypning både invasive og transport-isolater. Fortsæt med afprøvning af latexreagenserne med target og non-target pneumokokisolater som pr beskrevet i trin 3 og 4 nedenfor metode. Kvalitetskontrol reagenser på tidspunktet for produktionen og derefter mindst en gang årligt derefter. BEMÆRK: Hvis et reagens ikke går QC, skal partiet kasseres og en ny forberedelse foretaget. I tilfælde af gentagen QC svigt anbefaler vi reagenser fremstilles ved anvendelse af de alternative metoder beskrevet i Ortika et al. 2013 8 og i diskussionen nedenfor. 3. Fremstilling af Pneumokok kulturer til serotypning Ved hjælp af en steril løkke vælge en enkelt koloni af pneumokok isolere og stribefri dette ud på et fast ikke-selektivt blodagar, således at den primære inokulum omfatter omtrent en tredjedel af pladens overflade. Træk for enkelt kolonier. BEMÆRK: Plader fremstillet af defibrineret hest eller får blod, er egnede; men blod plader fremstillet med humant blod eller citreret dyreblod er ikke. Inkuber plade O / N ved 37 ° C i en atmosfære af 5% CO2. Overhold vækst på pladen for renhed og vurderer, at der er tilstrækkelig vækst til serotypning. BEMÆRK: En ren kultur af pneumokok-isolat er påkrævet til serotypning. Det er vores erfaring, sammenflydende, eller i nærheden af ​​sammenflydende vækst dækker cirka en tredjedel af pladens overflade er normalt tilstrækkeligt til at fuldføre serotypning. Som pneumokok kulturer kan være tilbøjelige til at autolyse, bør kulturer forberedt til serotypning testes inden for 24 timer af subkultur. Tag ikke dyrkningspladen ud af kuvøsen mere end 15 til 20 minutter før serotypning påbegyndes. 4. Gennemførelsen latexagglutinationstest Serotyping Fjern alle latexreagenserne fra køleskabet og lad dem varme op til stuetemperatur i caimately 30 min. Umiddelbart før brug, vend forsigtigt rørene for at blande reagenserne. Mærk et objektglas. Placer 15 pi negativ kontrol latexreagens på objektglasset. Ved hjælp af en steril engangs 1 gl løkke tage en feje af pneumokok-kultur, så krogen er ca halv fuld. Smøre forsigtigt inokulum på overfladen af ​​objektglasset tæt på dråbe negativ kontrol latexreagens. Inoculum skal være synlig på objektglasset. Blandes hurtigt og grundigt podestoffet i den negative kontrol latexreagens ved hjælp af løkken. Sørg for, at faldet ikke spredes videre end dens oprindelige størrelse. Afhente dias, holde det i begge ender. Rock slide frem og tilbage i 1 min. Sørge for at holde væsken bevæger sig langsomt, og sikre, at størrelsen af ​​dråben ikke øges. BEMÆRK: Alternativt kan en plade rocker. Overhold til makroskopisk agglutination (dvs. vedblotte øje) og clearing af suspensionen mod en sort baggrund. Hvis den negative kontrol latexreagens viser ingen agglutination eller rydning fortsætte teste kultur, som erstatter de test latexreagenserne for den negative kontrol latexreagens i trin 4,1-4,8 ovenfor. En frisk løkke skal bruges hver gang. Fortsæt med afprøvning af latexreagenserne starter med puljer. Test hver af de 'pulje' latexreagenserne i rækkefølge, indtil en positiv test er opnået. BEMÆRK:. Rækkefølgen af afprøvning af puljerne kan ske »runder« for at afspejle den lokale forekomst af bestemte serotyper (f.eks ved at teste for de tre mest sandsynlige puljer på første dias, hvis en positiv reaktion ikke er opnået, derefter teste de næste tre mest sandsynlige af de resterende puljer på den anden slæde, og så videre, indtil en positiv reaktion opnås). Dette sikrer, at de mest almindelige serotyper testes først, at minimere den tid og reagenser behov. Brug af antisera fabrikantens nøgle bestemme, hvilke individuelle antisera er repræsenteret i den positive pulje. Test hver af de grupper eller typer, der er indeholdt i den positive pulje individuelt for at bestemme den »gruppe« eller »type« som i trin 4,1-4,8 ovenfor. Bestem resultatet med henvisning til antisera fabrikantens nøgle. Hvis en »type« bestemmes (fx serotype 5), så er ingen behov for yderligere testning, og dette resultat registreres. Hvis en »gruppe« bestemmes (fx gruppe 19), og derefter henvise til fabrikanter nøglen til at bestemme de faktorer, der skal testes. Fortsætte med at teste med den enkeltes faktor «latexreagenserne og bestemme den endelige serotype (f.eks serotype 19B).

Representative Results

En positiv latex reaktion opstår, når typespecifikke antistof bundet til latexpartikel binder til kapslen af pneumokokker, og agglutination af antistof-mærkede partikler ensues 15. Figur 1A viser en positiv reaktion, som er kendetegnet ved synlig agglutination og clearing af baggrunden suspension. En negativ reaktion er kendetegnet ved latexagglutinationstest reagens suspensionen forbliver jævn og hvid (figur 1B). Reagenserne er optimeret, således at en positiv reaktion bør observeres inden udløbet af den ene min tidsinterval (normalt påvises i ca 20 sek). Vi anbefaler ikke at læse reaktioner efter 1 min tidsinterval. Meget lejlighedsvis vise reaktioner svag agglutination rundt i kanten af ​​den dråbe, der ikke er ledsaget af clearing af baggrunden suspension eller forekomme 'trævlet "med ingen baggrund clearing (data ikke vist). Disse er mest ligesom ly negative reaktioner. I sådanne tilfælde anbefaler vi, gentest og / eller foretage yderligere undersøgelser med en anden serotypning metode (f.eks Quellung reaktion 17). Figur 1. Positive og negative latexagglutinering reaktioner. Tilberedt pneumokok isolat blandet med latexagglutinering reagens viser en positiv reaktion (A) eller en negativ reaktion (B). Agglutinering ledsaget af rydning af baggrunden ses i positiv reaktion (A) .Der er ingen synlig agglutination med den negative kontrol latexreagens eller i en negativ test reaktion (B). Fotografier 8 anvendes med tilladelse."Target =" _blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Latexagglutinering er en enkel, hurtig og billig metode til pneumokok serotypning. Kommercielle pneumokok latexagglutinering reagenser er til rådighed, men de har i øjeblikket skelner ikke alle kendte pneumokokserotyper ^10,12. Dog kan latexagglutinering reagenser let fremstilles i-huset ved hjælp af indkøbt antisera rejst mod specifikke pneumokok kapselantigener. I den her beskrevne fremgangsmåde er antistoffer passivt bundet til latexpartikler at lave et sæt af latex agglutination reagenser.

En positiv latex reaktion opstår, når specifikke antistoffer bundet til latexpartikler tillægger antigener på polysaccharidkapslen af pneumokok isolere ^18,19. De latexpartikler, der er knyttet til antistofferne tillade specifik antistof-antigen-reaktion visualiseres uden forstørrelse.

Latexagglutinering er en egnet metode til high throughput laboratorier end også for ressourcesvage indstillinger. Vigtige fordele ved latexagglutinationstest metode er, at nogen specialiseret udstyr er påkrævet til at udføre testen, reagenser har en holdbarhed på mindst 2 år ved opbevaring ved 4 ° C ^8, og at den er billig, enkel og hurtig at udføre. Serotypning en pneumokok isolat af latexagglutinering tager cirka 10 minutter, og op til fire latexreagenserne kan testes parallelt på et objektglas. Desuden, hvis forekomsten af serotyper er kendt for de relevante epidemiologiske indstilling, prøvning kan udføres i runder starter med puljer, der indeholder de mest almindelige serotyper lighed med Quellung prøve ^17. Denne fremgangsmåde minimerer antallet af nødvendige tests for at bestemme serotype. Fremgangsmåden er også meget reproducerbar mellem forskellige operatører (data ikke vist). En ulempe ved latexagglutinationstest serotypning at fremstille reagenserne er tidskrævende, idet ca 4 timer; selvom flere ReageNTS kan nemt fremstilles parallelt. Desuden er nogle antigener er fælles på tværs af forskellige pneumokok serotyper, hvilket resulterer i krydsreaktioner med nogle antisera (f.eks serotype 29, 42 og Gruppe 35). Men disse krydsreaktioner godt karakteriseret ved brug af kommercielle antisera (som normalt præabsorberet at fjerne de mere problematiske krydsreagerende antistoffer) og yderligere reaktion tabeller leveres af producenten for at skelne hvilken serotype er til stede. Latex reagenser kan også krydse reagere, hvis antistofferne ikke er justeret korrekt på latexpartiklerne; disse er detekteret som QC fiaskoer. Det er vores erfaring, streng QC er central for succesen af ​​denne metode, selv når kommercielt tilgængelige antisera anvendes til produktion. QC tager cirka 15 minutter pr reagens og bygger på et sæt af passende QC isolater som beskrevet ovenfor.

Den her beskrevne metode resulterer i reagenser, der giver en positiv reaktion godt witynd testperioden. Det er vores erfaring, falske positiver er sjældne i praksis (data ikke vist). Lejlighedsvis falske negative reaktioner observeres; normalt disse vedrører kendte problemer med en bestemt antiserum (fx kan serogruppe 6 isolater ikke reagere med pool B antiserum) eller nedregulering af kapsel ekspression ved isolatet. Ved hjælp af serotypning algrorithm leveret af producenten er også vigtig, som i de fleste tilfælde en falsk positiv eller negativ reaktion vil føre til en "blind ende 'resultat. I disse tilfælde, og når reaktionerne er vanskeligt at fortolke, anbefaler vi gentage-test og / eller undersøgelser af en alternativ metode såsom Quellung reaktion.

Nogle fejlfinding lejlighedsvis forpligtet til at foretage en tilfredsstillende latex reagenser. I den her beskrevne fremgangsmåde er antistoffet bundet til latexpartikler via passiv adsorption ^15,19, så en kritisk variabel er den koncentration af antistof, der anvendes, som afgør, hvor godtoverfladen af latexpartikler er dækket, og den efterfølgende justering af antistof aktive sites ^15,20. Derfor, hvis utilstrækkelige eller overskydende antistof bundet til latexpartiklerne, antistof-antigen-reaktioner vil ikke være optimal, og utilfredsstillende reagenser kan fremstilles ^15,20,21. Som antistoftitere varierer mellem forskellige partier af antisera, kan et standard sæt af fortyndinger ikke producerer reagenser, der klarer sig godt ^8. Et godt udgangspunkt er at bruge en 1:40 fortynding af antiserum, og hvis dette ikke lykkes, fortyndes antiserum yderligere. Det er vores erfaring dette normalt løser problemet ^8. I et lille antal tilfælde reagenser kan vise svag agglutination, der ikke er ledsaget af rydning af suspensionen, når det testes med target-isolater. I disse tilfælde fortynding antiserum ikke forbedre kvaliteten af reagenset, men tilfredsstillende reagenser kan normalt fremstilles ved at udelade centrifugering og vask trin ^8,22 </sup>.

Antistofovertrukne latex partikler anvendes almindeligt i diagnostisk mikrobiologi til detektering, identificering eller serotypning af mange forskellige mikrober ^15,20. Som sådan kan den her beskrevne fremgangsmåde være egnet til fremstilling af latex reagenser til andre formål, forudsat passende antisera er til rådighed og tilstrækkelige QC procedurer er vedtaget.

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Microparticles based on polystyrene, 800 nm	Sigma	65984-10 ml-F	Or other volumes as required
Normal rabbit serum	Antibodies Australia	NRS-1ml	Or other volumes as required, bring to room temperature before use
Pneumococcus (Neufeld) antisera	SSI Diagnostica	Various	Bring to room temperature before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
Sterile Bovine Albumin	Sigma	A-4503	Bring to room temperature before use
Sodium azide 10% (v/v) solution	VWR International	ROAC3902/100ml	Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml	Eppendorf	0030 120.094	Round bottom
Sodium chloride	Merck	10241.AP
Calibrated disposable inoculating loops 1 µl	Copan	CD175SO1
Glass microscope slides 76 mm x 26 mm	Thermo Fisher Scientific	LBS 2950RC
5 M NaOH	BDH	10252	Caution: highly corrosive
Glycine	Merck	10119.05
Horse Blood Agar (HBA) plates	Thermo Fisher Scientific	PP2001	Bring to room temperature before use http://www.thermofisher.com.au
Rotating wheel	Wyble Engineering Development Corporation	Not available
Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml	Technoplas	S5016SU
60 ml syringes without needles	Terumo	SS-60L
Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm	Merck Millipore	SLGP033RS
Brochure on Neufeld antisera	Statens Serum Institut		Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
Key to pneumococcal factor serum	Statens Serum Institut	18058	For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica
*alternative sources are available for most materials