के सम्पुटी सीरोवर्गनिर्धारण<em> स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया</em> लेटेक्स समूहन द्वारा
Summary
लेटेक्स समूहन परीक्षण स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया सीरोवर्गनिर्धारण के लिए एक सरल, तेजी से और सस्ता तरीका है, और भी व्यापक रूप से नैदानिक सूक्ष्म जीव विज्ञान में लागू किया गया है. यह पांडुलिपि लेटेक्स समूहन अभिकर्मकों, गुणवत्ता नियंत्रण प्रक्रियाओं के घर में उत्पादन और न्यूमोकोकल सीरोवर्गनिर्धारण करने के लिए इस तकनीक के आवेदन का वर्णन करता है.
Abstract
Latex agglutination reagents are widely used in microbial diagnosis, identification and serotyping. Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus) is a major cause of morbidity and mortality world-wide. Current vaccines target the pneumococcal capsule, and there are over 90 capsular serotypes. Serotyping pneumococcal isolates is therefore important for assessing the impact of vaccination programs and for epidemiological purposes. The World Health Organization has recommended latex agglutination as an alternative method to the ‘gold standard’ Quellung test for serotyping pneumococci. Latex agglutination is a relatively simple, quick and inexpensive method; and is therefore suitable for resource-poor settings as well as laboratories with high-volume workloads. Latex agglutination reagents can be prepared in-house utilizing commercially-sourced antibodies that are passively attached to latex particles. This manuscript describes a method of production and quality control of latex agglutination reagents, and details a sequential testing approach which is time- and cost-effective.
This method of production and quality control may also be suitable for other testing purposes.
Introduction
स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया (pneumococcus) पांच साल से कम आयु के बच्चों में रुग्णता और मृत्यु दर का एक प्रमुख कारण है पुरानी दुनिया चौड़ा विशेष रूप से संसाधन गरीब सेटिंग्स 1,2 में,. ऐसे निमोनिया, पूति के रूप में जीवन धमकी स्थितियों के लिए स्थानीय संक्रमण से न्यूमोकोकल रोग पर्वतमाला और 1,2 मैनिंजाइटिस.
Pneumococci से अधिक 90 सीरमप्रकारों पहचान उनके सम्पुटी polysaccharide 3 में अंतर के आधार पर किया गया है. वर्तमान टीके सम्पुटी polysaccharide लक्ष्य और आक्रामक रोग 4 के कारण प्रमुख सीरमप्रकारों से सुरक्षा प्रदान करते हैं. न्यूमोकोकल आइसोलेट्स सीरोवर्गनिर्धारण गाड़ी और रोग पर टीकाकरण के प्रभाव का आकलन करने के साथ ही व्यापक महामारी जानकारी 5,6 प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण है. न्यूमोकोकल सीरोवर्गनिर्धारण के लिए वर्तमान 'सोने के मानक' विधि Quellung परीक्षण है, लेकिन यह समय लगता है और perfo के लिए कुछ कौशल की आवश्यकताआरएम 7. लेटेक्स समूहन विश्व स्वास्थ्य संगठन 7 से सिफारिश की एक वैकल्पिक सीरोवर्गनिर्धारण विधि है. लेटेक्स समूहन प्रदर्शन करने के लिए त्वरित और सरल है, और दुनिया भर में 8-11 कई प्रयोगशालाओं में कार्यरत है. महत्वपूर्ण बात है, लेटेक्स समूहन न्यूमोकोकल सीरोवर्गनिर्धारण 10,12-14 के लिए Quellung परीक्षण करने के लिए तुलनीय सटीकता दिखाया गया है. कुल मिलाकर, इस विधि संसाधन गरीब सेटिंग्स के साथ ही उच्च throughput प्रयोगशालाओं के लिए आदर्श है.
लेटेक्स समूहन अभिकर्मकों ('लेटेक्स अभिकर्मकों') लेटेक्स कणों से 15 एंटीबॉडी की कुर्की द्वारा बनाई गई हैं. एक सकारात्मक प्रतिक्रिया में, इन लेबल कणों विशिष्ट प्रतिजन की उपस्थिति में सरेस से जोड़ा हुआ. वाणिज्यिक लेटेक्स अभिकर्मकों सीरमप्रकारों की एक सीमित रेंज के लिए उपलब्ध हैं. लेटेक्स अभिकर्मकों भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध antisera 10 का उपयोग करते हुए घर में तैयार किया जा सकता है. Antisera के मिश्रण ('ताल') के साथ ही न्यूमोकोकल है के लिए विशिष्ट antiseraerogroups (जैसे, समूह 19), व्यक्तिगत सीरमप्रकारों (जैसे, सीरोटाइप 5), और विशिष्ट एंटीजन को ('कारकों', जैसे., सीरोटाइप 19A पहचानने कारक 19C) आगे समूहों के भीतर सीरमप्रकारों परिभाषित करने के लिए 16 उपलब्ध हैं.
यह पांडुलिपि लेटेक्स कणों को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध antisera के निष्क्रिय लगाव का उपयोग लेटेक्स अभिकर्मकों के उत्पादन में प्रमुख कदम की रूपरेखा. इस विधि की गुणवत्ता नियंत्रण (QC) के पहलुओं का वर्णन किया जाता है, और न्यूमोकोकल सीरोवर्गनिर्धारण के लिए लेटेक्स अभिकर्मकों के उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल है.
Protocol
Representative Results
Discussion
लेटेक्स समूहन न्यूमोकोकल सीरोवर्गनिर्धारण के लिए एक सरल, त्वरित और सस्ता तरीका है. वाणिज्यिक न्यूमोकोकल लेटेक्स समूहन अभिकर्मकों उपलब्ध हैं, लेकिन वे वर्तमान में सभी ज्ञात न्यूमोकोकल 10,12 सीरमप्रकारों अंतर नहीं है. हालांकि, लेटेक्स समूहन अभिकर्मकों आसानी से विशिष्ट न्यूमोकोकल सम्पुटी एंटीजन के खिलाफ उठाया खरीदा antisera का उपयोग घर में उत्पादन किया जा सकता है. यहाँ वर्णित विधि में, एंटीबॉडी निष्क्रिय लेटेक्स समूहन अभिकर्मकों का एक सेट बनाने के लिए लेटेक्स कणों से जुड़े होते हैं.
न्यूमोकोकल की polysaccharide कैप्सूल 18,19 अलग पर लेटेक्स कणों के लिए बाध्य विशिष्ट एंटीबॉडी एंटीजन को देते हैं जब एक सकारात्मक लेटेक्स प्रतिक्रिया होती है. एंटीबॉडी से जुड़ी लेटेक्स कणों विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिजन प्रतिक्रिया बढ़ाई बिना देखे जा करने की अनुमति.
लेटेक्स समूहन उच्च throughput प्रयोगशालाओं एक के लिए एक उपयुक्त तरीका हैसंसाधन गरीब सेटिंग्स के लिए भी होगी. लेटेक्स समूहन विधि का मुख्य लाभ कोई विशेष उपकरणों का परीक्षण करने के लिए आवश्यक है कि कर रहे हैं, अभिकर्मकों 4 डिग्री सेल्सियस 8 पर संग्रहीत जब कम से कम 2 साल की एक शैल्फ जीवन है, और यह सस्ती, सरल और जल्दी है कि प्रदर्शन करने के लिए. लेटेक्स समूहन द्वारा एक न्यूमोकोकल अलग सीरोवर्गनिर्धारण लगभग 10 मिनट लगते हैं, और ऊपर से चार लेटेक्स अभिकर्मकों एक स्लाइड पर समानांतर में परीक्षण किया जा सकता है. सीरमप्रकारों की व्यापकता प्रासंगिक महामारी विज्ञान सेटिंग के लिए जाना जाता है इसके अलावा, अगर, परीक्षण Quellung परीक्षण 17 को इसी प्रकार सबसे आम सीरमप्रकारों युक्त पूल के साथ शुरू राउंड में प्रदर्शन किया जा सकता है. यह दृष्टिकोण सीरोटाइप निर्धारित करने की जरूरत परीक्षणों की संख्या कम करता है. विधि भी अलग ऑपरेटरों के बीच अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है (नहीं दिखाया डेटा). लेटेक्स समूहन सीरोवर्गनिर्धारण का एक नुकसान अभिकर्मकों उत्पादन लगभग 4 घंटा ले रही है, समय लगता है कि है; कई Reage हालांकिएनटीएस आसानी से समानांतर में उत्पादन किया जा सकता है. इसके अलावा, कुछ एंटीजन कुछ antisera के साथ पार प्रतिक्रियाओं में जिसके परिणामस्वरूप विभिन्न न्यूमोकोकल सीरमप्रकारों भर में आम हैं (उदाहरण के लिए, सीरोटाइप 29, 42 और समूह 35). (आमतौर पर अधिक समस्याग्रस्त पार प्रतिक्रिया एंटीबॉडी को दूर करने के preabsorbed जाता है) वाणिज्यिक antisera और अतिरिक्त प्रतिक्रिया तालिकाओं का उपयोग मौजूद है जो सीरोटाइप भेद करने के क्रम में निर्माता द्वारा प्रदान की जाती हैं फिर भी, जब इन पार प्रतिक्रियाओं अच्छी तरह से विशेषता है. एंटीबॉडी लेटेक्स कणों पर ठीक से नहीं जुड़ रहे हैं तो भी पार कर सकते हैं लेटेक्स अभिकर्मकों प्रतिक्रिया; इन क्यूसी विफलताओं के रूप में पहचान कर रहे हैं. हमारे अनुभव में, कठोर QC व्यावसायिक रूप से उपलब्ध antisera उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है, तब भी जब इस विधि की सफलता के लिए केंद्रीय है. क्यूसी अभिकर्मक के अनुसार लगभग 15 मिनट लगते हैं और ऊपर वर्णित आइसोलेट्स के रूप में उपयुक्त क्यूसी का एक सेट पर निर्भर करता है.
यहाँ वर्णित विधि एक सकारात्मक प्रतिक्रिया अच्छी तरह से वाई दे कि अभिकर्मकों में परिणामपरीक्षण अवधि पतली. हमारे अनुभव में, झूठी सकारात्मक (नहीं दिखाया डेटा) अभ्यास में दुर्लभ हैं. समसामयिक झूठी नकारात्मक प्रतिक्रियाओं मनाया जाता है; आमतौर पर इन एक विशेष सीरमरोधी साथ ज्ञात समस्याओं (जैसे, सेरोग्रुप 6 वियोजन पूल बी सीरमरोधी के साथ प्रतिक्रिया नहीं कर सकते हैं), या अलग से कैप्सूल अभिव्यक्ति के नीचे विनियमन से संबंधित हैं. एक झूठी सकारात्मक या नकारात्मक प्रतिक्रिया एक 'अंधा' अंत परिणाम प्राप्त होंगे ज्यादातर मामलों में के रूप में निर्माता द्वारा प्रदान सीरोवर्गनिर्धारण algrorithm का उपयोग करना, यह भी महत्वपूर्ण है. प्रतिक्रियाओं की व्याख्या करना मुश्किल है जब इन मामलों में, और हम इस तरह के Quellung प्रतिक्रिया के रूप में एक वैकल्पिक विधि से दोहराने परीक्षण और / या जांच की सिफारिश.
कुछ समस्या निवारण कभी कभी संतोषजनक लेटेक्स अभिकर्मकों बनाने के लिए आवश्यक है. यहाँ वर्णित विधि में, एंटीबॉडी निष्क्रिय सोखना 15,19 के माध्यम से लेटेक्स कणों से जुड़ा हुआ है, इसलिए एक महत्वपूर्ण चर कैसे अच्छी तरह से निर्धारित करता है जो इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की एकाग्रता है,लेटेक्स कणों की सतह को कवर किया और एंटीबॉडी सक्रिय साइटों 15,20 के बाद संरेखण है. अपर्याप्त या अतिरिक्त एंटीबॉडी लेटेक्स कणों से जुड़ा हुआ है नतीजतन, अगर, एंटीबॉडी प्रतिजन प्रतिक्रियाओं इष्टतम नहीं होगा, और असंतोषजनक अभिकर्मकों 15,20,21 उत्पादन किया जा सकता है. एंटीबॉडी titers antisera के विभिन्न बहुत सारे के बीच अलग अलग रूप में, dilutions की एक मानक सेट में अच्छी तरह से 8 प्रदर्शन कि अभिकर्मकों उत्पादन नहीं हो सकता है. एक उपयोगी प्रारंभ बिंदु सीरमरोधी का एक 1:40 कमजोर पड़ने का उपयोग करने के लिए है, और यह सफल नहीं है, तो आगे सीरमरोधी पतला. हमारे अनुभव में यह आम तौर पर समस्या 8 निराकरण करता है. मामलों की एक छोटी संख्या में अभिकर्मकों लक्ष्य आइसोलेट्स के साथ परीक्षण किया जब निलंबन के समाशोधन के साथ नहीं है कि कमजोर समूहन दिखा सकते हैं. अभिकर्मक की गुणवत्ता में सुधार नहीं करता है, लेकिन संतोषजनक अभिकर्मकों आमतौर पर centrifugation omitting द्वारा उत्पादित किया जा सकता है और धोने 8,22 कदम सीरमरोधी गिराए इन मामलों में </sup>.
एंटीबॉडी लेपित लेटेक्स कणों कई विभिन्न रोगाणुओं 15,20 का पता लगाने, पहचान या सीरोवर्गनिर्धारण के लिए नैदानिक सूक्ष्म जीव विज्ञान में आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं. जैसे, यहाँ वर्णित विधि अन्य प्रयोजनों के लिए लेटेक्स अभिकर्मकों की तैयारी के लिए उपयुक्त हो सकता है, बशर्ते उपयुक्त antisera उपलब्ध है और पर्याप्त QC प्रक्रिया को अपनाया जाता है.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was part of the PneuCarriage project, funded by the Bill and Melinda Gates Foundation with contribution by the Victorian Government’s Operational Infrastructure Support Program.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Microparticles based on polystyrene, 800 nm | Sigma | 65984-10 ml-F | Or other volumes as required |
| Normal rabbit serum | Antibodies Australia | NRS-1ml | Or other volumes as required, bring to room temperature before use |
| Pneumococcus (Neufeld) antisera | SSI Diagnostica | Various | Bring to room temperature before use http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
| Sterile Bovine Albumin | Sigma | A-4503 | Bring to room temperature before use |
| Sodium azide 10% (v/v) solution | VWR International | ROAC3902/100ml | Caution: hazardous if inhaled; skin and eye irritant |
| Eppendorf Safe-Lock tubes, 2 ml | Eppendorf | 0030 120.094 | Round bottom |
| Sodium chloride | Merck | 10241.AP | |
| Calibrated disposable inoculating loops 1 µl | Copan | CD175SO1 | |
| Glass microscope slides 76 mm x 26 mm | Thermo Fisher Scientific | LBS 2950RC | |
| 5 M NaOH | BDH | 10252 | Caution: highly corrosive |
| Glycine | Merck | 10119.05 | |
| Horse Blood Agar (HBA) plates | Thermo Fisher Scientific | PP2001 | Bring to room temperature before use http://www.thermofisher.com.au |
| Rotating wheel | Wyble Engineering Development Corporation | Not available | |
| Polystyrene flat bottom screw cap tube, 5 ml | Technoplas | S5016SU | |
| 60 ml syringes without needles | Terumo | SS-60L | |
| Millex-GP syringe filter unit, 0.22 µm | Merck Millipore | SLGP033RS | |
| Brochure on Neufeld antisera | Statens Serum Institut | Key to determining serotypes http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
|
| Key to pneumococcal factor serum | Statens Serum Institut | 18058 | For determining serotype within Groups http://www.ssi.dk/ssidiagnostica |
| *alternative sources are available for most materials | |||
Riferimenti
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