Real-Time impedans-baserede Cell Analyzer som et værktøj til at afgrænse Molekylær baner for neurotoksicitet og Neurobeskyttelse i en neuronal cellelinje
Summary
Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.
Abstract
Mange hjerne-relaterede lidelser har neuroncelledød involveret i deres patofysiologi. Forbedret in vitro-modeller for at studere neurobeskyttende eller neurotoksiske effekter af lægemidler og downstream veje involverede ville hjælpe at få indsigt i de molekylære mekanismer i neuroprotektion / neurotoksicitet og kan potentielt lette lægemiddeludvikling. Men mange eksisterende in vitro-toksicitet analyser har store begrænsninger – de fleste vurdere neurotoksicitet og neurobeskyttelse på et enkelt tidspunkt, ikke gør det muligt at overholde de frister, kursus og kinetik for effekten. Desuden vil muligheden for at indsamle oplysninger om downstream signalveje involveret i neuroprotektion i realtid være af stor betydning. I den nuværende protokol beskriver vi anvendelsen af en tidstro impedans-baserede celle analysator for at bestemme neurobeskyttende virkninger af serotonin 2A (5-HT-2A)-receptoragonister i en neuronal cellelinje under etiket-fri og tidstro conditionioner ved hjælp af impedans målinger. Endvidere viser vi, at inhibitorer af second messenger-veje kan anvendes til at afgrænse downstream-molekyler, der er involveret i neurobeskyttende virkning. Vi beskriver også anvendeligheden af denne teknik til at bestemme, om en virkning på celleproliferation bidrager til en observeret neurobeskyttende virkning. Systemet anvender særlige mikroelektroniske plader benævnt E-plader, som indeholder alternerende guld mikroelektrode-arrays på bundfladen af brøndene, der tjener som celle sensorer. Impedansen udlæsning modificeres ved antallet af adhærente celler, cellelevedygtighed, morfologi og adhæsion. En dimensionsløs parameter kaldet Cell indeks er afledt af den elektriske impedans målinger, og bruges til at repræsentere cellen status. Samlet set realtids-impedans-baserede celle analysator giver mulighed for real-time, etiket-fri vurdering af neurobeskyttelse og neurotoksicitet, og en evaluering af second messenger veje engagement, der bidrager til meredetaljeret og højkapacitetsidentifikation vurdering af potentielle neurobeskyttende forbindelser in vitro til udvælgelse af terapeutiske kandidater.
Introduction
Neuronal celledød spiller en kritisk rolle i patofysiologien af mange hjerne-relaterede lidelser 1. Tilgængeligheden af pålidelig og høj-throughput in vitro toksicitet analyser er afgørende for at få bedre indsigt i de mekanismer for neurotoksicitet og at hjælpe vælge neurobeskyttende molekyler som terapeutiske kandidater i medicin udvikling 2. Men der er mange begrænsninger for de mest anvendte in vitro-neurotoksicitet assays.They vurdere neurotoksicitet / neuroprotection på en enkelt gang-point ikke tillader kinetisk beslutning; bruger ofte etiket eller sonde, som kan forstyrre de signalveje og begrænse yderligere undersøgelser i den samme celle befolkning, og er ofte arbejdskrævende, og i mange tilfælde ikke giver mekanistisk indsigt. I den foreliggende undersøgelse demonstrere vi anvendeligheden af en real-time impedans-baserede celle analysator til at bestemme neurotoksicitet og neurobeskyttelse i en neuronal cellelinje i realtid og under etiket-fribetingelser, og at give indsigt i downstream mekanismer gennem analyse af second messenger veje involveret i effekt.
Tidligere undersøgelser har bekræftet gyldigheden af real-time celle analysator at bestemme cytotoksicitet samt effekter på celleproliferation i cellelinjer i sammenligning med standard teknikker 3,4,5,6. For eksempel blev en god korrelation mellem udlæsninger af standard cellelevedygtighed WST-1 analysen og Cell indeksværdier på flere tidspunkter under basale spredning betingelser og efter to forskellige toksiske paradigmer i HeLa-celler 3. I A549 og MDA-MB-231 celler proliferation og cytotoksicitet provokeret med mikrotubulus stabilisator paclitaxel viste meget ens værdier, når vurderes ved Cell Index målinger og standardmæssigt anvendes sulforhodamin B (SRB) analyse 4. I den neuronale cellelinie immortaliserede hippocampusneuroner HT-22 Cell Index målinger blev valideret for deres evne to detektere celleproliferation, glutamat cytotoksicitet og cytobeskyttelse mod udbredte 3 (4,5-dimethylthiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium-bromid (MTT)-assay 5. I samme undersøgelse MTT analyseresultater og Cell Indeks målinger korrelerede også godt i målingen neuronale stamceller spredning, cytotoksicitet efter vækstfaktorer afsavn og redning af cytotoksicitet ved den pan-caspaseinhibitor QVD 5. Cytotoksicitet induceres i NIH 3T3 celler ved Vandetanib (vaskulær endotel vækstfaktor-receptoren og epidermal vækstfaktor-receptor-inhibitor) viste lignende resultater målt med Cell indeksværdier eller neutral rød optagelse assay 6.
Vi har for nylig anvendt realtid celle analysator system til at vurdere neurobeskyttende virkninger af serotonin 2A (5-HT-2A) receptoragonist (±) -2,5-dimethoxy-4-iodoamphetamine hydrochlorid (DOI) i en neuronal cellelinje ( SK-N-SH-celler) og screenet for inddragelse af second messenger veje gennem overvåger virkningen af deres kemiske hæmning på den observerede neurobeskyttelse 7. Interessant, 5-HT 2A-receptoren har både hallucinogene og nonhallucinogenic agonister (som DOI og lisurid, henholdsvis), som kan aktivere både almindelige og distinkte second messenger veje 8.
Fordelene ved den præsenterede teknik er, at det giver mulighed for at indsamle oplysninger i realtid om celle overlevelse i løbet af dage, for at afgrænse anden messenger veje er involveret, for at vurdere mulige bidrag spredning effekter til neurobeskyttelse, og for at vælge en optimal tid yderligere end-point studier på samme celle population. Et skematisk diagram af arbejdsgangen i den nuværende protokol er vist i figur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den nuværende protokol viser nytten af en real-time celle analysator løbende og under etiket-fri betingelser for at vurdere de neurobeskyttende / neurotoksiske effekter af forbindelser i neuronale cellelinjer og for at få indsigt i de second messenger veje involveret i effekt.
Selvom realtid celle analysator værktøj til at studere cytotoksicitet og virkningerne af lægemidler på celleproliferation er generelt anerkendt, har kun få studier brugt det i neuronale relaterede cellety…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financial support for the experiments presented in the study was provided by the Marie Heim-Vögtlin program of the Swiss National Science Foundation.
We thank Ms. Johanna Nyffeler for developing a set of modified MATLAB programs for screening for statistically significant differences in real-time cell analyzer’s data and Dr. Yama Abassi for helpful discussion.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | for culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC – (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| tisue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | for culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | for trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | automated cell counter |
| phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | for washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294,002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | for dissolving LY-294,002 and lisuride maleate |
Riferimenti
- Cavallucci, V., D’Amelio, M. Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases. Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).
- Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. Focus on Neurological Diseases. , (2007).
- Ke, N., Wang, X., Xu, X., Abassi, Y. A. The xCELLigence system for real-time and label-free monitoring of cell viability. Methods Mol. Biol. 740, 33-43 (2011).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Diemert, S., et al. Impedance measurement for real-time detection of neuronal cell death. J. Neurosci. Methods. 203 (1), 69-77 (2012).
- Kustermann, S., et al. A label-free, impedance-based real time assay to identify drug-induced toxicities and differentiate cytostatic from cytotoxic effects. Toxicol In Vitro. 27 (5), 1589-1595 (2013).
- Marinova, Z., Walitza, S., Grünblatt, E. 5-HT2A serotonin receptor agonist DOI alleviates cytotoxicity in neuroblastoma cells: role of the ERK pathway. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 44, 64-72 (2013).
- González-Maeso, J., et al. Hallucinogens recruit specific cortical 5-HT(2A) receptor-mediated signaling pathways to affect behavior. Neuron. 53 (3), 439-452 (2007).
- Tsuchioka, M., Takebayashi, M., Hisaoka, K., Maeda, N., Nakata, Y. Serotonin (5-HT) induces glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF) mRNA expression via the transactivation of fibroblast growth factor receptor 2 (FGFR2) in rat C6 glioma cells. J. Neurochem. 106 (1), 244-257 (2008).
- Galante, D., et al. Differential toxicity, conformation and morphology of typical initial aggregation states of Aβ1-42 and Aβpy3-42 beta-amyloids. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 44 (11), 2085-2093 (2012).
- Sheline, C. T., Cai, A. L., Zhu, J., Shi, C. Serum or target deprivation-induced neuronal death causes oxidative neuronal accumulation of Zn2+and loss of NAD. Eur. J. Neurosci. 32, 894-904 (2010).
