एक neuronal सेल लाइन में न्यूरोटॉक्सिटी और neuroprotection में शामिल आणविक मार्ग चित्रित करने के लिए एक उपकरण के रूप में वास्तविक समय प्रतिबाधा आधारित सेल विश्लेषक
Summary
Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.
Abstract
कई मस्तिष्क संबंधी विकार उनके pathophysiology में शामिल neuronal सेल मौत है. दवाओं और neuroprotection / न्यूरोटॉक्सिटी के आणविक तंत्र में जानकारी पाने और संभावित दवा के विकास की सुविधा सकता मदद मिलेगी शामिल बहाव के रास्ते में से न्यूरोप्रोटेक्टिव या neurotoxic प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में सुधार हुआ. हालांकि, कई मौजूदा इन विट्रो विषाक्तता assays के प्रमुख सीमाएं हैं – सबसे नहीं समय पाठ्यक्रम और प्रभाव के कैनेटीक्स निरीक्षण करने के लिए अनुमति देता है, एक ही समय बिंदु पर न्यूरोटॉक्सिटी और neuroprotection का आकलन करें. इसके अलावा, वास्तविक समय में neuroprotection में शामिल बहाव के संकेत दे रास्ते के बारे में जानकारी इकट्ठा करने के लिए अवसर बहुत महत्व का होगा. मौजूदा प्रोटोकॉल में हम लेबल से मुक्त और वास्तविक समय Condit के तहत एक neuronal सेल लाइन में सेरोटोनिन 2A (5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A) रिसेप्टर एगोनिस्ट के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव का निर्धारण करने के लिए एक वास्तविक समय प्रतिबाधा आधारित सेल विश्लेषक के उपयोग का वर्णनप्रतिबाधा माप का उपयोग कर आयनों. इसके अलावा, हम दूसरे के दूत रास्ते में से अवरोधकों न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव में शामिल बहाव के अणुओं को चित्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रदर्शित करता है. हम भी सेल प्रसार पर असर मनाया न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव में योगदान देता है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए इस तकनीक की उपयोगिता का वर्णन है. प्रणाली, कुओं के नीचे की सतह पर सोना microelectrode सरणियों बारी सेल सेंसर के रूप में सेवारत होते हैं जो ई प्लेट्स के रूप में भेजा विशेष शास्त्रीय प्लेटों का इस्तेमाल करता. प्रतिबाधा readout पक्षपाती कोशिकाओं, सेल व्यवहार्यता, आकृति विज्ञान, और आसंजन की संख्या से संशोधित किया गया है. सेल इंडेक्स कहा जाता है एक आयामरहित पैरामीटर विद्युत प्रतिबाधा माप से प्राप्त होता है और सेल स्थिति का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कुल मिलाकर, वास्तविक समय प्रतिबाधा आधारित सेल विश्लेषक अधिक योगदान करने के लिए, वास्तविक समय, neuroprotection और न्यूरोटॉक्सिटी के लेबल से मुक्त मूल्यांकन, और दूसरा दूत रास्ते भागीदारी के मूल्यांकन के लिए अनुमति देता हैचिकित्सकीय उम्मीदवारों के चयन के लिए इन विट्रो में संभावित न्यूरोप्रोटेक्टिव यौगिकों की विस्तृत और उच्च throughput आकलन.
Introduction
Neuronal सेल मौत कई मस्तिष्क संबंधी विकार 1 के pathophysiology में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इन विट्रो विषाक्तता assays में विश्वसनीय और उच्च throughput की उपलब्धता न्यूरोटॉक्सिटी के तंत्र में बेहतर जानकारी हासिल करने और नशीली दवाओं के विकास 2 में चिकित्सीय उम्मीदवार के रूप में न्यूरोप्रोटेक्टिव अणुओं का चयन करने में मदद करने के लिए महत्वपूर्ण है. हालांकि, सबसे व्यापक रूप से गतिज संकल्प की अनुमति नहीं एक समय बिंदु पर न्यूरोटॉक्सिटी / neuroprotection आकलन इन विट्रो न्यूरोटॉक्सिटी assays.They में इस्तेमाल करने के लिए कई सीमाएं हैं; अक्सर संकेत दे रास्ते के साथ हस्तक्षेप और एक ही सेल की आबादी में अतिरिक्त पढ़ाई की सीमा, और अक्सर श्रम प्रधान हैं, और कई मामलों में यंत्रवत अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं कर सकते हैं जो लेबल या जांच का उपयोग करें. वर्तमान अध्ययन में हम वास्तविक समय में और नीचे एक neuronal सेल लाइन में न्यूरोटॉक्सिटी और neuroprotection निर्धारित करने के लिए एक वास्तविक समय प्रतिबाधा आधारित सेल विश्लेषक की उपयोगिता का प्रदर्शन लेबल से मुक्तस्थितियां प्रभाव में शामिल दूसरा दूत रास्ते के विश्लेषण के माध्यम से बहाव तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए और.
पिछले अध्ययनों मानक तकनीक 3,4,5,6 के साथ तुलना में cytotoxicity के साथ ही सेल लाइनों में सेल प्रसार पर प्रभाव का निर्धारण करने के लिए वास्तविक समय सेल विश्लेषक की वैधता की पुष्टि की है. उदाहरण के लिए, एक अच्छे संबंध बेसल प्रसार परिस्थितियों में और HELA कोशिकाओं 3 में दो अलग विषाक्त मानदंड के बाद कई समय बिंदुओं पर मानक सेल व्यवहार्यता WST-1 परख की readouts और सेल इंडेक्स वैल्यू के बीच मनाया गया. सेल सूचकांक माप द्वारा मूल्यांकन और standardly इस्तेमाल किया sulforhodamine बी (SRB) परख 4 जब microtubule स्थिरता प्राप्त Paclitaxel साथ उकसाया A549 और एमडीए MB-231 कोशिकाओं के प्रसार और cytotoxicity में बहुत समान मूल्यों दिखाया. अमर hippocampal न्यूरॉन्स के neuronal सेल लाइन में एचटी -22 सेल सूचकांक माप उनकी क्षमता टी के लिए मान्य किया गयाओ व्यापक रूप से इस्तेमाल 3 (4,5-dimethylthiazol-2-YL) के खिलाफ सेल प्रसार, ग्लूटामेट cytotoxicity और cytoprotection 2,5-diphenyltetrazolium-ब्रोमाइड (MTT) परख 5 का पता लगाने. इसी अध्ययन में MTT परख परिणाम और सेल सूचकांक माप भी अखिल कस्पासे अवरोध QVD 5 से वृद्धि कारकों के अभाव और cytotoxicity के बचाव के बाद neuronal पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के प्रसार, cytotoxicity मापने में अच्छी तरह से सहसंबद्ध. Vandetanib (संवहनी endothelial वृद्धि कारक रिसेप्टर और epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर अवरोध) द्वारा एनआईएच 3T3 कोशिकाओं में प्रेरित cytotoxicity सेल इंडेक्स वैल्यू या तटस्थ लाल तेज परख 6 से मापा इसी तरह के परिणाम से पता चला है.
हमने हाल ही में सेरोटोनिन 2A के न्यूरोप्रोटेक्टिव प्रभाव का आकलन करने के लिए वास्तविक समय सेल विश्लेषक प्रणाली का इस्तेमाल किया है (5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A) रिसेप्टर agonist (±) -2,5-dimethoxy-4-iodoamphetamine हाइड्रोक्लोराइड एक neuronal सेल लाइन में (DOI) ( एस एन एसएच कोशिकाओं) और SECO की भागीदारी के लिए जांचमनाया neuroprotection 7 पर उनकी रासायनिक निषेध के प्रभाव की निगरानी के माध्यम से एन डी दूत रास्ते. दिलचस्प है, 5 हिंदुस्तान टाइम्स 2A रिसेप्टर आम और विशिष्ट दूसरा दूत रास्ते 8 दोनों को सक्रिय कर सकते हैं जो (DOI और lisuride, क्रमशः) की तरह hallucinogenic और nonhallucinogenic दोनों एगोनिस्ट है.
प्रस्तुत तकनीक का लाभ यह दिन के कोर्स में सेल अस्तित्व पर वास्तविक समय की जानकारी एकत्र करने के लिए neuroprotection के लिए प्रसार प्रभाव के संभावित योगदान का आकलन करने के लिए, और एक इष्टतम समय का चयन करने के लिए, दूसरी दूत रास्ते शामिल चित्रित करने के लिए अनुमति देता है कि कर रहे हैं एक ही सेल की आबादी पर अतिरिक्त अंत बिंदु के अध्ययन के लिए. मौजूदा प्रोटोकॉल में कार्यप्रवाह का एक योजनाबद्ध आरेख चित्र 1 में प्रस्तुत किया है.
Protocol
Representative Results
Discussion
मौजूदा प्रोटोकॉल लगातार और लेबल से मुक्त परिस्थितियों में neuronal सेल लाइनों में यौगिकों की न्यूरोप्रोटेक्टिव / neurotoxic प्रभाव का आकलन करने के लिए और प्रभाव में शामिल दूसरा दूत रास्ते में जानकारी हासिल करने …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Financial support for the experiments presented in the study was provided by the Marie Heim-Vögtlin program of the Swiss National Science Foundation.
We thank Ms. Johanna Nyffeler for developing a set of modified MATLAB programs for screening for statistically significant differences in real-time cell analyzer’s data and Dr. Yama Abassi for helpful discussion.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| xCELLigence RTCA SP system bundle | ACEA Biosciences | No: 00380601030 | consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit |
| E-plate 96 | ACEA Biosciences | No: 05232368001 | for culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station |
| SK-N-SH cells | ATCC – (in partnership with LGC Standards) | HTB-11 | can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D8437 | cell culture medium |
| fetal bovine serum | Life Technologies | 16140-063 | supplements proliferation, but not serum deprivation medium |
| tisue culture flask T175 | Sarstedt | 83.1812.302 | for culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96 |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | for trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks |
| Scepter 2.0 cell counter | Merck Millipore | PHCC20060 | automated cell counter |
| phosphate-buffered saline | Life Technologies | 10010-015 | for washing the cells |
| (±)-DOI hydrochloride | Sigma-Aldrich | D101 | 5-HT2A agonist for cell culture treatment |
| LY-294,002 hydrochloride | Sigma-Aldrich | L9908 | PI3-K inhibitor for cell culture treatment |
| lisuride maleate | Tocris Bioscience | 4052 | compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment |
| dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D4540 | for dissolving LY-294,002 and lisuride maleate |
Riferimenti
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