Real-Time Impedans-baserte Cell Analyzer som et verktøy å avgrense molekylære stier involvert i Neurotoksisitet og nevro i en Neuronal cellelinje

Summary

Improved in vitro neurotoxicity assays would aid the identification of new neuroprotective compounds. The utility of a real-time impedance-based cell analyzer to determine cytotoxicity and cytoprotection in neuronal cell lines and to delineate the involvement of second messenger pathways, thus gaining insight in the mechanism of neuroprotection is presented.

Abstract

Mange hjerne-relaterte lidelser har neuronal celledød er involvert i deres patofysiologi. Forbedret in vitro modeller for å studere nervecellene eller nevrotoksiske effekter av narkotika og nedstrøms trasé involvert ville bidra til å få innsikt i de molekylære mekanismene for neurobeskyttelse / nevrotoksisitet og kan potensielt lette narkotika utvikling. Men mange eksisterende in vitro toksisitetsanalyser har store begrensninger – mest vurdere nevrotoksisitet og neurobeskyttelse hos en enkelt tidspunkt, ikke tillater å observere den tid-kurs og kinetikken av den virkning. Videre vil muligheten til å samle inn informasjon om nedstrøms signalveier involvert i nevro i sanntid være av stor betydning. I den nåværende protokoll beskriver vi bruken av en sanntids-impedans-baserte celle analysator for å bestemme nevrobeskyttende effekter av serotonin 2A (5-HT _2A) reseptoragonister i en neuronal cellelinje i henhold til etikett-fri og sanntids conditioner ved hjelp impedansmålinger. Videre viser vi at inhibitorer av andre messenger-veier kan brukes for å avgrense nedstrøms molekyler som er involvert i nevrobeskyttende virkning. Vi beskriver også anvendelsen av denne teknikken for å bestemme om en effekt på celleproliferasjon bidrar til en observert neurobeskyttende effekt. Systemet benytter spesielle mikroelektroniske platene referert til som e-platene som inneholder alternerende gull microelectrode matriser på den nederste overflaten av brønnene, som tjener som cellefølere. Impedansen avlesning er modifisert ved antallet adherente celler, celle-levedyktighet, morfologi og adhesjon. En dimensjonsløs parameter som kalles celleindeks er avledet fra de elektriske impedansmålinger, og blir brukt til å representere den celletilstand. Samlet sett gir sanntids impedans-baserte celle analysator for real-time, etikett-fri vurdering av nevro og nevrotoksisitet, og evaluering av andre messenger trasé engasjement, bidrar til merdetaljert og high-throughput vurdering av potensielle nevrobeskyttende forbindelser in vitro, for valg av terapeutiske kandidater.

Introduction

Nevronal celledød spiller en avgjørende rolle i patofysiologien av mange hjernerelaterte lidelser ^en. Tilgjengeligheten av pålitelig og høy gjennomstrømming in vitro toksisitets analysene er avgjørende for å få bedre innsikt i mekanismene for nevrotoksisitet og bidra til å velge nervecellene molekyler som terapeutisk kandidater i legemiddelutvikling ^to. Det er imidlertid mange begrensninger til de mest brukte in vitro nevrotoksisitet assays.They vurdere neurotoksisitet / neurobeskyttelse hos en enkelt tidspunkts ikke tillater kinetiske oppløsning; bruker ofte etikett eller sonde som kan forstyrre signalveier og begrense ytterligere studier i samme cellepopulasjon, og er ofte arbeidskrevende, og i mange tilfeller ikke gir mekanistisk innsikt. I den foreliggende undersøkelse viser at det er nytten av en sanntids-impedans-baserte celle analysator for å bestemme neurotoksisitet og nevrobeskyttelse i en neuronal cellelinje i sanntid og under etiketten frittforhold og for å gi innsikt i nedstrøms mekanismer gjennom analyse av andre messenger-veier som er involvert i virkningen.

Tidligere studier har bekreftet gyldigheten av sanntids-celle analysator for å bestemme cytotoksisitet samt virkninger på celleformering i cellelinjer i sammenligning med standardteknikker ^3,4,5,6. For eksempel ble en god korrelasjon observert mellom avlesninger av standard celle levedyktighet WST-1-analysen og celleindeksverdier på flere tidspunkter i henhold basal spredningsforhold og etter to forskjellige giftige paradigmer i HeLa celler ^tre. I A549 og MDA-MB-231 celler spredning og cytotoksisitet provosert med microtubuli stabilisator paclitaxel viste svært like verdier når vurdert av Cell Index målinger og standardly brukt sulforhodamine B (SRB) assay ^fire. I nevronale cellelinje av udødeliggjort hippocampus nevroner HT-22 Cell Index målinger ble validert for sin evne to detektere celleproliferasjon, glutamat cytotoksisitet og cytoprotection mot den mye brukte 3-(4,5-dimetyl-tiazol-2-yl) 2,5-diphenyltetrazolium-bromid (MTT) assay ^5. I den samme studien MTT analyseresultatene og Cell Index målinger også korrelert godt i måling nevronale stamceller spredning, cytotoksisitet etter vekstfaktorer deprivasjon og redning av cytotoksisitet av pan-caspase inhibitor Qvd ^fem. Cytotoksisitet indusert i NIH 3T3-celler ved Vandetanib (vaskulær endotelial vekstfaktor-reseptor, og epidermal vekstfaktor-reseptor-inhibitor), viste tilsvarende resultater målt med Cell indeksverdier eller nøytral-rød opptaksanalyse ^6..

Vi har nylig benyttet sanntidscelleanalysesystemet for å vurdere nevrobeskyttende effekter av serotonin 2A (5-HT _2A) reseptoragonist (±) -2,5-dimetoksy-4-iodoamphetamine hydroklorid (DOI) i en neuronal cellelinje ( SK-N-SH-celler) og skjermet for involvering av second messenger-veier gjennom overvåke effekten av deres kjemiske hemming på den observerte neurobeskyttelse ^7.. Interessant nok har 5-HT _2A reseptor både hallusinogene og nonhallucinogenic agonister (som DOI og lisurid, henholdsvis), som kan aktivere både felles og distinkte andre messenger trasé ^åtte.

Fordelene med den fremlagte teknikk er at det gjør det mulig å samle informasjon i sanntid om celleoverlevelse i løpet av dager, for å avgrense andre messenger-veier som er involvert, for å vurdere den mulige bidrag av spredningseffekter til nevrobeskyttelse, og for å velge en optimal tids for ytterligere end-point-studier på den samme cellepopulasjon. Et skjematisk diagram av arbeidsflyten i den aktuelle protokoll er presentert i figur 1.

Protocol

1. Forberedelse Plasser sanntidscelle analysator stasjon i en vevskultur-inkubator innstilt på 37 ° C og med 5% CO2. Utføre alle cellekultur håndtering og farmakologisk behandling i en vev kultur hette under sterile forhold. MERK: Neuronal cellelinjer som krever ulike temperaturinnstillinger i forhold til standard forhold for kultur, bør justeres tilsvarende. For svakt adherente cellelinjer, bruk beleggsmidler for å lette interaksjonen av celler med gullmikroelektroder i bunnen av b…

Representative Results

Serum deprivasjon fører til reduksjon i celle indeksverdier, som kan overvåkes kontinuerlig med sanntids celle analysator Neurotoksiske stimuli til cellene fører til en reduksjon i celleindeksverdier, som kan overvåkes i sanntid med den fremlagte teknikk og dynamikken av disse er avhengig av det spesifikke nevrotoksisk stimulus og celletype undersøkt. Figur 2 viser økningen i Cell Index når SK-N-SH-celler dyrkes i spredning medium til å nå et …

Discussion

Den nåværende protokollen presenterer nytten av en real-time celle analysator til kontinuerlig å vurdere og under merkefrie forhold de nervecellene / nevrotoksiske effekter av forbindelser i nevronale cellelinjer og å få innsikt i de andre messenger trasé involvert i effekt.

Selv om sanntids celle analysator verktøyet for å studere cytotoksisitet og effekten av medikamenter på celleproliferasjon er generelt anerkjent, har bare noen få studier anvendes den i neuronale relaterte cell…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
xCELLigence  RTCA SP system bundle	ACEA Biosciences	No: 00380601030	consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit
E-plate 96	ACEA Biosciences	No: 05232368001	for culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station
SK-N-SH cells	ATCC – (in partnership with LGC Standards)	HTB-11	can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8437	cell culture medium
fetal bovine serum	Life Technologies	16140-063	supplements proliferation, but not serum deprivation medium
tisue culture flask T175	Sarstedt	83.1812.302	for culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054	for trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks
Scepter 2.0 cell counter	Merck Millipore	PHCC20060	automated cell counter
phosphate-buffered saline	Life Technologies	10010-015	for washing the cells
(±)-DOI hydrochloride	Sigma-Aldrich	D101	5-HT2A agonist for cell culture treatment
LY-294,002 hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9908	PI3-K inhibitor for cell culture treatment
lisuride maleate	Tocris Bioscience	4052	compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment
dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540	for dissolving LY-294,002 and lisuride maleate