酵母核内体系统的超微结构分析的纳米金标记
Summary
酵母， 酿酒酵母 ，一直是一个关键模式生物识别和研究基因调节内体系统的生物合成和功能。在这里，我们提出了内体车厢的超微结构研究特定的标签一个详细的协议。
Abstract
内涵体是主要的膜排序在真核细胞中的检查点中的一个和它们调节回收的蛋白质或毁坏大多从质膜和高尔基体。其结果是内体系统在维持细胞稳态中发挥中心作用，并在属于该网络的细胞器通过小泡运输相互连接的基因的突变，引起严重的病症，包括癌症和神经生物学障碍。因此，黄金的相关性是理解内涵体系统的生物合成和组织相关的机制。 酿酒酵母中一直举足轻重的完成这项任务。要明确标示，并在超微结构水平这一模式生物的内体系统的分析，我们在座的带正电荷的纳米金摄取原生质其次是这些粒子通过银增强反应可视化的详细协议。这种方法也是一种宝贵的太l适用于与内体运输缺陷突变体的形态学检查。此外，它不仅适用于超微结构检查，但它也可与免疫标号用于蛋白质定位的调查相结合。
Introduction
内体系统中起着至关重要的多种细胞的作用包括贩运溶酶体酶分选受体和质膜（PM）的回收受体1,2的主要膜分拣设备。内涵体被划分在三个不同的车厢， 即 。在早期内涵体（EE），晚期内涵体（LE）和回收内涵体。这种分类是基于它需要的内吞物质到达他们，对特定的标记蛋白，并且在其形态的时间。膜， 即蛋白质和脂质双层，从PM内在设计可以通过内体输送到溶酶体中降解或再循环回。膜也被输送到内涵体从高尔基体，同样，要么继续溶酶体或检索返回到高尔基体。此外，蛋白质可以分为管腔囊泡从内体界膜，这一过程导致形成向内出芽子类别LE时，多泡体。
酵母胞内体系统是相对较不复杂的较高的真核细胞中的一个。酵母胞内体分为EE和LE。相反，哺乳动物细胞中不含有回收内涵体，而且组织特异性溶酶体相关细胞器。因此，他们有一个不太复杂的内体的贩运路线3,4的网络。因此，酵母曾代表仍然表示一个有利的实验系统，研究一些基础原则膜交通的内体系统。这个优点是通过以下事实，涉及该内体途径的许多基因已被初步分离与遗传筛选在酵母5强调。 而酵母胞内体系统中的野生型和突变的细胞已被广泛采用的生化和荧光显微镜方法的研究，其在超微结构水平调查至今只有最小的。形态分析是特别相关的酵母，因为大部分核内体的细胞器被检测为通过荧光显微镜圈点结构，这使得他们难以明确识别6。不幸的是抗血清仅有限数量识别酵母胞内蛋白标志物是工作在免疫电子显微镜（IEM）制剂7-10。对于一些蛋白质，这个问题已经绕过由感兴趣的基因的内源性标记和使用的抗体识别，检测它7,11,12和标签。然而，通常蛋白是因为它们的低表达水平的检测不到的IEM。他们的表达是不是一个解决方案，因为这种方法可以诱导误本地化和/或改建中的细胞器形态/功能。因此，内吞区室中与探针可检测通过电子显微镜EM标签是一种有效的选择。这是特别是如果一个最优解的公关OBE是进入细胞内吞途径中以时间依赖性方式，它允许知道什么时候会标记一个特定的细胞器6。
带正电荷的纳米级金的酵母原生质球（ 即 ，酵母，其中细胞壁已酶促去除）的摄取已经被成功地用于识别酵母胞内隔室10。这些颗粒牢固结合到带负电荷的脂质构成的生物膜。因此，带正电荷的纳米级金的联系人与PM，穿透细胞通过内吞作用和通过EE和LE到达液泡之前。这些小的金颗粒，但是，没有一个合适的尺寸由EM待观察。以使它们可见，它们的大小可通过化学反应，导致银或金的周围的黄金探测器13-15的沉积被放大。我们已经开发并成功应用的IEM方法的基础上，得安方法来执行的亚细胞定位研究8,16。这种方法允许进行酵母制剂免疫标记与形态8,17-24一个出色的分辨率。我们还建立了一个程序结合本IEM协议与酵母核内体系统的纳米金标记舱6。使用这种方法，我们已形态学特征内涵体的不同亚类和超微结构研究突变体与内体运输缺陷6,25。此外，我们已经证明，这种纳米金标记可以与免疫标号提供探索对不同亚群内体目标蛋白的分布的可能性相结合。在这里，我们介绍如何在酵母核内体系统的带正电的纳米金标记实际上是执行。
Protocol
Representative Results
Discussion
免疫电子显微术是一种技术，它允许结合蛋白的定位与在这些蛋白质所在的载体和细胞器的超微结构分辨率。研究了酵母核内体系统时，因为它的车厢出现点状结构，在荧光显微镜中，这一点尤其重要。因此它是难以区分它们。由于这个原因，用一个探针通过EM检测并输入的内吞途径中一个时间依赖的方式是非常重要的特异性标记不同内涵体。这种类型的探针是有价值的，以评估细胞内吞作用…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢勒Scriwanek与图编制的援助。 FR是由ECHO（700.59.003）的支持，ALW打开程序（821.02.017和822.02.014），DFG-NWO合作（DN82-303）和ZonMW VICI（016.130.606）资助。
Materials
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2.6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 ̊C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 ̊C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc. , Warrington, PA | 216 | store at 4 ̊C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at 4 ̊C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35 º | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100mmx15mm petri dishe | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
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