Nanogold Labeling van de Gist endosomale systeem voor Ultrastructurele Analyses
Summary
Gist, Saccharomyces cerevisiae, heeft een sleutelrol modelorganisme om genen die de biogenese en functies van het endosomale systeem te identificeren en te bestuderen geweest. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de specifieke kenmerken van de endosomale compartimenten voor ultrastructurele studies.
Abstract
Endosomen zijn een van de belangrijkste membraan sorteren controlestations in eukaryote cellen en ze reguleren recycling of vernietiging van eiwitten voornamelijk uit de celmembraan en het Golgi. Door het endosomale systeem speelt een centrale rol in het handhaven celhomeostase en mutaties in genen die tot dit netwerk van organellen verbonden door vesiculair transport, ernstige pathologieën waaronder kanker en neurobiologische aandoeningen. Het is daarom van het grootste belang om de mechanismen die ten grondslag liggen van de biogenese en de organisatie van het endosomale systeem te begrijpen. De gist Saccharomyces cerevisiae is cruciaal geweest bij deze taak. Om specifiek te etiketteren en te analyseren op het ultrastructurele niveau het endosomale systeem van dit model organisme, presenteren we hier een gedetailleerd protocol voor de positief geladen Nanogold opname door sferoplasten gevolgd door de visualisatie van deze deeltjes door middel van een versterking met zilver reactie. Deze methode is ook een waardevol tel voor de morfologische onderzoek van mutanten met defecten in endosomaal transport. Bovendien is niet alleen voor ultrastructurele onderzoek maar kan ook gecombineerd worden met immuno labelings voor eiwit lokalisatie onderzoeken.
Introduction
De endosomale systeem is een belangrijke membraan sorteerinrichting die meerdere cruciale cellulaire functies, waaronder handel in lysosomale enzym sorteren receptoren en de recycling van plasmamembraan (PM) speelt receptoren 1,2. Endosomen worden onderverdeeld in drie compartimenten, dwz. de vroege endosomen (EE), de late endosomen (LE) en de recycling endosomes. Deze indeling is gebaseerd op de tijd die het duurt voor endocytosed materiaal om hen te bereiken, op specifieke marker-eiwitten en op hun morfologie. Membranen, dwz eiwit en lipidendubbellagen geïnternaliseerd van de PM kan ofwel lysosomen worden geleverd via endosomes voor degradatie of worden teruggevoerd. Membranen zijn ook vervoerd endosomen naar het Golgi en evenzo hetzij verder lysosomen of teruggestuurd naar de Golgi opgehaald. Bovendien kunnen eiwitten worden gesorteerd in luminale vesicles binnenwaarts knopvorming aan het endosomale membraan beperken, een proces dat leidt tot de vorming vaneen subcategorie van LE, de multivesiculaire lichamen.
De gist endosomale systeem relatief minder complex dan die van hoge eukaryotische cellen. Gist endosomes zijn verdeeld in EE en LE. In tegenstelling tot zoogdiercellen en niet recycling endosomen maar ook weefselspecifieke-lysosoom gerelateerde organellen bevatten. Daarom hebben ze een minder complex netwerk van endosomaal smokkelroutes 3,4. Daarom gist heeft vertegenwoordigd en vormt nog steeds een voordelige experimenteel systeem om een aantal van de principes onderliggende membraan verkeer studeren in het endosomale systeem. Dit voordeel wordt benadrukt door het feit dat vele genen betrokken bij de endosomale paden zijn aanvankelijk geïsoleerd met genetische screens in gist 5. Terwijl de gist endosomale systeem in wild-type en mutante cellen is uitgebreid bestudeerd met behulp van biochemische en fluorescentie microscopie benaderingen, heeft haar onderzoek op het ultrastructurele niveau alleen geweestminimaal. Morfologische analyses zijn met name relevant in gist, omdat de meeste van de endosomal organellen worden gedetecteerd als puntlaesies structuren met behulp van fluorescentie microscopie, die moeilijk hun ondubbelzinnige identificatie 6 maken. Er is een beperkt aantal antisera herkennen gist endosomen markers werkt in immuno-elektronen-microscopie (IEM) preparaten 7-10. Voor sommige eiwitten, is dit probleem omzeild door de endogene tagging van het gen van belang en het gebruik van een antilichaam dat het label om het 7,11,12 detecteren. Vaak echter, eiwitten zijn niet op te sporen door IEM vanwege hun lage expressie niveaus. Hun overexpressie is geen oplossing, want deze aanpak mis-lokalisatie en / of wijzigingen kunnen veroorzaken in het organel morfologie / functies. Dus de etikettering van de endocytische compartimenten met een probe detecteerbaar door elektronenmicroscopie EM is een effectieve optie. Dit is een optimale oplossing vooral als de probe betreedt de endocytische route een tijdsafhankelijke wijze, waardoor weten wanneer het een bepaalde organel 6 zal markeren.
De opname van positief geladen Nanogold door gistsferoplasten (dwz. Gist waar de celwand is enzymatisch verwijderd) is met succes gebruikt voor identificatie van de gist endosomale compartimenten 10. Deze deeltjes sterk binden aan de negatief geladen lipiden waaruit de biologische membranen. Dus de positief geladen Nanogold associeert met de PM, dringt de cel door endocytose en loopt door het EE en LE alvorens de vacuole. Deze kleine gouddeeltjes hebben echter geen adequate afmetingen zichtbaar EM. Om ze zichtbaar te maken, kan de grootte worden vergroot door chemische reacties die leiden tot de afzetting van zilver of goud om de gouden sonde 13-15. We hebben ontwikkeld en met succes toegepast een IEM aanpak op basis van de Tokuyasu methode om subcellulaire voerenlokalisatie bestudeert 8,16. Deze methode maakt het uitvoeren immunogold etikettering op gist preparaten met een uitstekende resolutie van de morfologie 8,17-24. We hebben ook vastgesteld in een procedure te combineren IEM protocol met de Nanogold etikettering van de gist endosomal systeem compartimenten 6. Met deze aanpak hebben we morfologisch gekarakteriseerd verschillende subklassen van endosomes en ultrastructureel onderzocht mutanten met een endosomaal transport defect 6,25. Bovendien hebben we aangetoond dat deze Nanogold kenmerken te combineren met immunogoud labelings die de mogelijkheid om de verdeling van een eiwit van belang van de verschillende subpopulaties endosoom verkennen. Hier presenteren we hoe de etikettering van de gist endosomal systeem met positief geladen Nanogold praktisch wordt uitgevoerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immuno-elektron-microscopie is een techniek waarmee combineren lokalisatie van eiwitten met de ultrastructurele resolutie van de dragers en organellen wanneer deze eiwitten bevinden. Dit is vooral van cruciaal belang bij het bestuderen van de gist endosomale systeem, omdat haar compartimenten verschijnen als puntlaesies structuren in fluorescentie microscopie. Het is derhalve moeilijk te onderscheiden. Daarom is het gebruik van een probe detecteerbaar door EM en het invoeren van de endocytische route op een tijdsafhanke…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken Rene Scriwanek voor de hulp bij de voorbereiding van de figuur. FR wordt ondersteund door ECHO (700.59.003), ALW Open Programma (821.02.017 en 822.02.014), DFG-NWO samenwerking (DN82-303) en ZonMW VICI (016.130.606) subsidies.
Materials
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2.6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 ̊C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 ̊C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc. , Warrington, PA | 216 | store at 4 ̊C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at 4 ̊C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35 º | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100mmx15mm petri dishe | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
Riferimenti
- Gruenberg, J. The endocytic pathway: a mosaic of domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).
- Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks. Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).
- Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. Lysosomes: fusion and function. Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Meel, E., Klumperman, J. Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system. Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).
- Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).
- Griffith, J., Reggiori, F. Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure. J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).
- Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting. Dev Cell. 3, 271-282 (2002).
- Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 9, 1060-1072 (2008).
- Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway. Traffic. 3, 37-49 (2002).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (3), 847-858 (1998).
- Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells. Traffic. 8, 471-485 (2007).
- Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry. J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).
- Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin. Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).
- Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).
- Cabrera, M., et al. Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering. J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).
- Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).
- Nair, U., et al. SNARE proteins are required for macroautophagy. Cell. 146, 290-302 (2011).
- Jacquier, N., et al. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Karanasios, E., et al. Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p. Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).
- Mari, M., et al. An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis. J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).
- Nair, U., et al. A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis. Autophagy. 8, 780-793 (2012).
- Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).
- Erpapazoglou, Z., et al. A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting. Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).
- Tuinen, E., Riezman, H. Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level. J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Morphology of the yeast endocytic pathway. Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
- Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New frontiers in gold labeling. J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).
