Nanogold étiquetage du système levure endosomique pour les analyses ultrastructurales
Summary
Levure, Saccharomyces cerevisiae, a été un organisme modèle clé pour identifier et étudier les gènes qui régissent la biogenèse et les fonctions du système endosomal. Nous présentons ici un protocole détaillé pour le marquage spécifique des endosomes pour les études ultrastructurales.
Abstract
Endosomes sont l'un des principaux membrane tri des points de contrôle dans les cellules eucaryotes et ils régulent le recyclage ou la destruction des protéines principalement de la membrane plasmique et l'appareil de Golgi. En conséquence, le système de l'endosome joue un rôle central dans le maintien de l'homéostasie des cellules, et des mutations dans les gènes appartenant à ce réseau interconnectés par des organelles de transport vésiculaire, provoquent des pathologies graves telles que le cancer et les troubles neurobiologiques. Il est donc de l'intérêt premier de comprendre les mécanismes qui sous-tendent la biogenèse et l'organisation du système endosomal. La levure Saccharomyces cerevisiae a joué un rôle essentiel dans cette tâche. Pour étiqueter spécifiquement et analyser au niveau ultrastructural le système endosomal de cet organisme modèle, nous présentons ici un protocole détaillé pour l'absorption d'Nanogold chargé positivement par les sphéroplastes suivie par la visualisation de ces particules par une réaction d'amplification de l'argent. Cette méthode est également une valeur tropl pour l'examen morphologique des mutants avec des défauts dans le trafic endosomal. En outre, il n'est pas seulement applicable pour les examens ultrastructuraux mais il peut aussi être combiné avec des marquages immunomarquage investigations protéine de localisation.
Introduction
Le système de l'endosome est un appareil de tri de la membrane majeur qui joue plusieurs rôles cruciaux cellulaires y compris le trafic de l'enzyme lysosomale récepteurs de tri et le recyclage de la membrane plasmique (PM) 1,2 récepteurs. Les endosomes sont divisés en trois compartiments, à savoir différentes. les endosomes précoces (EE), les endosomes tardifs (LE) et les endosomes de recyclage. Cette classification est basée sur le temps nécessaire pour que la matière endocytose pour les atteindre, sur des protéines marqueurs spécifiques et de leur morphologie. Membranes, soit protéiques et lipidiques bicouches, intériorisées de la PM peuvent soit être livrés à lysosomes via les endosomes de dégradation ou être recyclés. Membranes sont également transportés vers les endosomes de l'appareil de Golgi et de même, soit continuer à les lysosomes ou être récupérées vers l'appareil de Golgi. En outre, les protéines peuvent être triés dans des vésicules luminales herbe vers l'intérieur à partir de la membrane de l'endosome limitatif, un processus qui conduit à la formation d'une sous-catégorie de LE, les corps multivésiculaires.
Le système de l'endosome de levure est relativement moins complexe que celle des cellules eucaryotes élevées. endosomes de levure sont divisés en EE et LE. Par contraste avec les cellules de mammifères ne contiennent pas les endosomes de recyclage, mais également des organites apparentés aux lysosomes spécifiques d'un tissu. Par conséquent, ils ont un réseau moins complexe de voies de trafic endosomes 3,4. Par conséquent levure a représenté et représente un système expérimental avantageux d'étudier quelques-uns des principes trafic membranaire sous-jacente dans le système endosomal encore. Cet avantage est renforcé par le fait que de nombreux gènes impliqués dans les voies de endosomes ont été initialement isolé avec des écrans génétiques dans la levure 5. Bien que le système endosomal de levure dans le type sauvage et des cellules mutantes a été étudiée en utilisant des approches de microscopie par fluorescence et biochimiques, son enquête au niveau ultrastructural a seulement étéminime. Analyses morphologiques sont particulièrement pertinentes dans la levure, car la plupart des organites endosomes sont détectés comme des structures ponctuées par microscopie à fluorescence, qui rendent difficile leur identification sans équivoque 6. Malheureusement, seul un nombre limité d'antisérums reconnaissant des marqueurs protéiques de levure endosomes travaille en immuno-microscopie électronique (IEM) Préparations 7-10. Pour certaines protéines, ce problème a été contourné par le marquage endogène du gène d'intérêt et l'utilisation d'un anticorps reconnaissant l'étiquette à détecter 7,11,12. Souvent, cependant, les protéines sont indétectables par IEM en raison de leurs faibles niveaux d'expression. Leur surexpression n'est pas une solution parce que cette approche peut induire mis-localisations et / ou des modifications dans les organites morphologie / fonctions. Ainsi, le marquage des compartiments endocytaires avec une sonde détectable par microscopie électronique EM est une option efficace. Il s'agit d'une solution optimale en particulier si le probe entre dans la voie d'endocytose de manière dépendante du temps, ce qui permet de savoir quand il va marquer un organite spécifique 6.
L'absorption de Nanogold chargé positivement par sphéroplastes de levure (c'est à dire. Levure où la paroi cellulaire a été éliminé par voie enzymatique) a été utilisée avec succès pour identifier le endosomes de levure compartiments 10. Ces particules se lient fortement aux lipides chargés négativement composant les membranes biologiques. Ainsi, les associés de Nanogold chargés positivement avec le PM, pénètre dans la cellule par endocytose et passe à travers la EE LE et avant d'atteindre la vacuole. Ces petites particules d'or, cependant, n'ont pas une taille appropriée pour être vu par EM. Pour les rendre visibles, leur taille peut être agrandie par des réactions chimiques qui conduisent à la déposition de l'argent ou de l'or de la sonde de l'or de 13 à 15. Nous avons mis au point et appliqué avec succès une approche IEM basé sur la méthode Tokuyasu pour effectuer subcellulaireétudie la localisation 8,16. Cette méthode permet d'effectuer l'étiquetage immunologique sur des préparations de levure avec une excellente résolution de la morphologie 8,17-24. Nous avons également mis en place une procédure combinant ce protocole IEM avec l'étiquetage de Nanogold du système levure endosomique compartiments 6. En utilisant cette approche, nous avons caractérisé morphologiquement différentes sous-classes de endosomes et ultrastructuralement examiné mutants avec un trafic endosomal défaut 6,25. De plus, nous avons démontré que cet étiquetage de Nanogold peut être combiné avec marquages immunomarquage offrant la possibilité d'explorer la distribution d'une protéine d'intérêt sur les différentes sous-populations de endosomes. Nous présentons ici les modalités d'étiquetage du système levure endosomique avec Nanogold chargé positivement est pratiquement réalisée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immuno-microscopie électronique est une technique qui permet de combiner la localisation des protéines à la résolution ultrastructurale des transporteurs et des organites où ces protéines résident. Cela est particulièrement important lorsque l'on étudie le système levure endosomique parce que ses compartiments apparaissent comme des structures ponctuées en microscopie de fluorescence. Il est donc difficile de les distinguer. Pour cette raison, l'utilisation d'une sonde détectable par microscopie …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient René Scriwanek pour l'aide à la préparation de la figure. FR est soutenu par ECHO (700.59.003), ALW Open Program (821.02.017 822.02.014 et), la coopération DFG-NWO (DN82-303) et ZonMw VICI (016.130.606) de subventions.
Materials
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2.6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 ̊C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 ̊C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc. , Warrington, PA | 216 | store at 4 ̊C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at 4 ̊C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35 º | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100mmx15mm petri dishe | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
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