Nanogold Markierung der Hefe Endosomale System für Ultrastrukturanalysen
Summary
Hefe, Saccharomyces cerevisiae, war ein wichtiger Modellorganismus zu identifizieren und zu untersuchen Gene Regelung der Biogenese und Funktion des endosomalen Systems. Hier präsentieren wir eine detaillierte Protokoll für die spezifische Markierung von den Endosomen für ultrastrukturelle Studien.
Abstract
Endosomen sind einer der Hauptmembransortier Checkpoints in eukaryotischen Zellen, und sie Verwertung oder Vernichtung von Proteinen regulieren hauptsächlich von der Plasmamembran und Golgi. Als Ergebnis der endosomalen System spielt eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase Zelle, und Mutationen in Genen zu diesem Netzwerk von Organellen durch Vesikeltransport miteinander verbunden gehören, verursachen schwere Erkrankungen wie Krebs und neurobiologischen Erkrankungen. Es ist daher von größter Bedeutung, um die Mechanismen der Biogenese und der Organisation des endosomalen System zugrunde liegen. Die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist in dieser Aufgabe entscheidend. Um spezifisch zu markieren und zu analysieren, auf ultrastruktureller Ebene die endosomalen System dieser Modellorganismus, hier präsentieren wir eine detaillierte Protokoll für die positiv geladenen Nanogold-Aufnahme durch Spheroplasten gefolgt von der Visualisierung dieser Teilchen durch eine Silberverstärkung Reaktion. Dieses Verfahren ist auch ein wertvoller zul für die morphologische Untersuchung von Mutanten mit Defekten in endosomalen Handel. Darüber hinaus ist es nicht nur anwendbar für ultrastrukturelle Untersuchung kann aber auch mit Immun Markierungen zur Proteinlokalisierung Untersuchungen kombiniert werden.
Introduction
Die endosomalen System ist ein Hauptmembransortiervorrichtung, die mehrere entscheidende Rollen einschließlich Mobilhandel lysosomalen Enzyms Sortier Rezeptoren und das Recycling von Plasmamembran (PM)-Rezeptoren spielt 1,2. Endosomen in drei Kammern, nämlich unterteilt. die frühen Endosomen (EE), die späten Endosomen (LE) und die Recycling-Endosomen. Diese Einstufung basiert auf der Zeit, die für die Endozytose Material, um sie zu erreichen, auf die bestimmte Markerproteine und über deren Morphologie. Membranen, dh Protein-und Lipiddoppelschichten, von der PM verinnerlicht kann entweder über Endosomen zu den Lysosomen zum Abbau geliefert werden oder zurückgeführt werden. Membranen werden auch Endosomen vom Golgi transportiert und in ähnlicher Weise entweder weiterhin Lysosomen oder zurück zu den Golgi abgerufen werden. Weiterhin können Proteine in luminalen Vesikel angeh nach innen von der endosomalen Grenzmembran, ein Verfahren, das zur Bildung von führt sortierteine Unterkategorie der LE, die multivesikulären Körpern.
Die Hefe endosomalen System ist relativ weniger komplex als die der Hoch eukaryotischen Zellen. Hefe Endosomen in EE und LE unterteilt. Im Gegensatz zu Säugerzellen sie Recycling Endosomen als auch gewebespezifische Lysosom bedingten Organellen enthalten. Folglich haben sie ein weniger komplexes Netzwerk von Handelsrouten endosomalen 3,4. Daher Hefe vertreten und stellt noch immer eine vorteilhafte experimentelle System, einige der zugrunde liegenden Prinzipien Membran Verkehr in der endosomalen System zu studieren. Dieser Vorteil wird durch die Tatsache, dass zahlreiche Gene in den Endosomen Wegen beteiligt wurden zunächst mit genetischen Screens in Hefe isoliert 5 hervorgehoben. Während die Hefe endosomalen System in Wildtyp-und mutierten Zellen wurde ausgiebig mit biochemischen und Fluoreszenzmikroskopie Ansätze untersucht, hat ihre Untersuchung auf ultrastruktureller Ebene erst seitminimal. Morphologische Analysen sind in der Hefe besonders relevant, weil die meisten der endosomalen Organellen werden als punktförmigen Strukturen, die durch Fluoreszenz-Mikroskopie, die ihre zweifelsfreie Ermittlung schwierig machen 6 nachgewiesen. Leider nur eine begrenzte Anzahl von Antiseren erkennen Hefe endosomalen Protein-Marker in immunelektronenmikroskopische Arbeits (IEM) Zubereitungen 7-10. Bei einigen Proteinen wurde dieses Problem durch die Markierung des endogenen Gens von Interesse, und die Verwendung eines Antikörper, der das Etikett, um es zu erfassen, 7,11,12 umgangen. Oft jedoch sind Proteine nachweisbar durch IEM wegen ihrer niedrigen Expressionsniveaus. Die Überexpression ist keine Lösung, weil dieser Ansatz falsch Lokalisierungen und / oder Änderungen in den Organellen-Morphologie / Funktionen zu induzieren. So ist die Beschriftung der endozytischen Fächer mit einer Sonde durch Elektronenmikroskopie EM nachweisbar ist eine wirksame Option. Dies ist eine optimale Lösung, insbesondere wenn die probe ist die Eingabe der endozytischen Route in einem zeitabhängig, was zu wissen, wenn es eine spezifische Organelle 6 kennzeichnen können.
Die Aufnahme von positiv geladenen Nanogold durch Hefe Spheroplasten (Hefe, wo die Zellwand enzymatisch entfernt also.) Erfolgreich verwendet worden, um die Hefe zu identifizieren endosomalen Fächer 10. Diese Partikel stark an die negativ geladenen Lipide, aus denen die biologischen Membranen zu binden. Somit werden die positiv geladenen Nanogold assoziiert mit dem PM, dringt in die Zelle durch Endocytose und gelangt durch die EE und LE vor Erreichen der Vakuole. Diese kleinen Goldpartikel, jedoch nicht über eine geeignete Größe von EM gesehen werden. Um sie sichtbar zu machen, kann ihre Größe durch chemische Reaktionen, die zur Abscheidung von Silber oder Gold auf der Goldsonde 13-15 führen vergrößert werden. Wir haben uns entwickelt und erfolgreich angewandt eine IEM-Ansatz auf der Basis der Tokuyasu Methode, um subzelluläre durchführenLokalisierungsstudien 8,16. Diese Methode ermöglicht die Durchführung Immunogoldmarkierung auf Hefe Zubereitungen mit einem hervorragenden Auflösung der Morphologie 8,17-24. Wir haben auch eine Kombination dieser Verfahren IEM Protokoll mit der Nano-Gold-Markierung des Hefe endosomalen System Fächer 6. Mit diesem Ansatz haben wir morphologisch charakterisiert verschiedenen Unterklassen der Endosomen und ultrastrukturell untersucht Mutanten mit einem Defekt endosomalen Handel 6,25. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass diese Nanogold-Markierung kann mit Immun Markierungen bietet die Möglichkeit, die Verteilung eines Proteins von Interesse in den verschiedenen Subpopulationen Endosom erkunden kombiniert werden. Hier präsentieren wir, wie die Kennzeichnung der Hefe endosomalen System mit positiv geladenen Nanogold praktisch durchgeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immuno-Elektronenmikroskopie ist eine Technik, kombiniert Lokalisierung von Proteinen mit der ultra Auflösung der Träger und Organellen, in denen diese Proteine befinden können. Dies ist besonders wichtig, wenn die Untersuchung der Hefe endosomalen System, weil seine Fächer erscheinen als punktförmigen Strukturen in der Fluoreszenzmikroskopie. Es ist daher schwierig, sie zu unterscheiden. Aus diesem Grund ist der Einsatz einer Sonde nachweisbar EM und Eingabe der endocytischen Weg in einer zeitabhängigen Wei…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken René Scriwanek für die Unterstützung bei der Vorbereitung der Abbildung. FR wird von ECHO (700.59.003) unterstützt, ALW-Open-Programm (821.02.017 und 822.02.014), DFG-NWO Zusammenarbeit (DN82-303) und ZonMW VICI (016.130.606) Zuschüsse.
Materials
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2.6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 ̊C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 ̊C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc. , Warrington, PA | 216 | store at 4 ̊C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at 4 ̊C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35 º | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100mmx15mm petri dishe | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
Riferimenti
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