Nanogold תיוג של מערכת endosomal שמרים לניתוח Ultrastructural
Summary
שמרים, שמר האפייה, כבר אורגניזם מודל מפתח כדי לזהות וללמוד גנים המסדירים את קיום החיים ופונקציות של מערכת endosomal. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתיוג הספציפי של תאי endosomal ללימודי ultrastructural.
Abstract
Endosomes אחד של הקרום הגדול מיון מחסומים בתאי אוקריוטים והם מווסתים מחזור או הרס של חלבונים בעיקר מקרום הפלזמה וGolgi. כתוצאה מכך מערכת endosomal ממלאת תפקיד מרכזי בשמירה על הומיאוסטאזיס, ומוטציות בגנים השייכים לרשת זו של האברונים מחוברים על ידי תחבורת ועי, לגרום לפתולוגיות חמורות, כולל סרטן והפרעות הנוירוביולוגי. לכן זה רלוונטי ראש כדי להבין את המנגנונים העומדים בבסיס קיום החיים והארגון של מערכת endosomal. שמרי Saccharomyces cerevisiae היה מרכזי במשימה זו. לתייג באופן ספציפי ולנתח ברמת ultrastructural מערכת endosomal של אורגניזם מודל זה, אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט לספיגת nanogold הטעונה חיובי על ידי spheroplasts אחריו ההדמיה של חלקיקים אלה באמצעות תגובת שיפור כסף. שיטה זו מדי יקר היא גםl לבחינה מורפולוגית של מוטציות עם מומים בסחר endosomal. יתר על כן, זה לא ישים רק לבחינות ultrastructural אבל זה גם יכול להיות משולב עם labelings immunogold לחקירות לוקליזציה חלבון.
Introduction
מערכת endosomal היא מנגנון קרום גדול שמיון משחק תפקידים סלולריים חיוניים רבים, כולל סחר בקולטנים מיון אנזים lysosomal והמחזור של קרום פלזמה (PM) קולטניים 1,2. Endosomes מחולקת בשלושה תאים שונים, כלומר. endosomes המוקדמת (EE), endosomes המאוחרת (LE) וendosomes המיחזור. סיווג זה מבוסס על המשך הזמן שלוקח לחומר endocytosed להגיע אליהם, על חלבוני סמן ספציפיים ועל המורפולוגיה שלהם. ממברנות, כלומר bilayers חלבונים ושומנים בדם, הפנימו מPM יכולים להיות מועברות לlysosomes באמצעות endosomes לשפלה או להיות ממוחזרות בחזרה. ממברנות גם מועברים לendosomes מGolgi ובאופן דומה, או להמשיך lysosomes או להאסף בחזרה לGolgi. יתר על כן, ניתן למיין חלבונים לתוך שלפוחית luminal ניצנים פנימה מן קרום endosomal מגביל, תהליך שמוביל להיווצרות שלקטגוריית משנה של LE, גופי multivesicular.
מערכת endosomal השמרים היא יחסית פחות מורכב מזו של תאי אוקריוטים גבוהים. endosomes שמרים מחולקות לEE ו LE. בניגוד לתאי יונקים הם אינם מכילים endosomes מחזור אלא גם אברונים הקשורות לליזוזום רקמות ספציפיות. כתוצאה מכך שיש להם רשת פחות מורכבת של נתיבי סחר endosomal 3,4. לכן שמרים ייצג ועדיין מייצג את מערכת ניסיונית יתרון ללמוד חלק מתנועת הממברנה הבסיסית העקרונות במערכת endosomal. יתרון זה מודגש על ידי העובדה כי גנים רבים המעורבים במסלולי endosomal היו מבודדים בתחילה עם מסכי גנטיים בשמרים 5. בעוד מערכת endosomal השמרים בסוג בר ותאים שעברו מוטציה, נחקרה בהרחבה שימוש בגישות מיקרוסקופית ביוכימי וקרינה, את חקירתה ברמת ultrastructural כבר רקמינימאלי. ניתוחים מורפולוגיים הם רלוונטיים במיוחד בשמרים, כי רוב האברונים endosomal מזוהים כמו מבני פיסוק על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשר הופכים קשה זיהוי חד משמעי שלהם 6. למרבה הצער רק מספר מוגבל של נסיובי הכרת סמני חלבון השמרים endosomal הוא עובד באימונו אלקטרון מיקרוסקופיה הכנות (IEM) 7-10. לחלבונים מסוימים, בעיה זו כבר לעקוף על ידי התיוג אנדוגני של הגן של עניין והשימוש בנוגדן הכרת התג לזהות אותו 7,11,12. לעתים קרובות, לעומת זאת, חלבונים הם לגילוי על ידי IEM בגלל רמות הביטוי הנמוכה שלהם. ביטוי היתר שלהם הוא לא פתרון, כי גישה זו יכולה לגרום לאי – מגוירת ו / או שינויים במורפולוגיה / פונקציות אברון. כך התיוג של תאי endocytic עם בדיקה לזיהוי על ידי EM במיקרוסקופ אלקטרונים הוא אפשרות יעילה. זה פתרון אופטימלי במיוחד אם יחסי הציבורOBE הוא להיכנס למסלול endocytic באופן תלוי בזמן, המאפשר לדעת מתי זה יהיה סימן אברון ספציפי 6.
הספיגה של nanogold הטעון חיובי על ידי spheroplasts שמרים (כלומר. שמרים שבו תא הקיר הוסר אנזימים) בהצלחה נעשתה שימוש כדי לזהות את שמרי endosomal מלתחות 10. חלקיקים אלה מאוד להיקשר לשומנים טעונים השלילי המרכיבים את הקרומים הביולוגיים. כך מקורבי nanogold הטעונים חיובי עם ראש הממשלה, חודרים את התא על ידי אנדוציטוזה ועוברים דרך EE וLE לפני שהגיע לvacuole. חלקיקי זהב הקטנים אלה, עם זאת, אין לי גודל מתאים כדי להיראות על ידי EM. כדי להבהיר להם גלויים, הגודל שלהם יכול להיות מוגדל על ידי תגובות כימיות שיובילו לתצהיר של כסף או זהב סביב חללית זהב 13-15. פיתחנו ויישמו בהצלחה גישת IEM מבוססים על שיטת Tokuyasu לבצע subcellularלוקליזציה לומדת 8,16. שיטה זו מאפשרת ביצוע תיוג immunogold על שמרי הכנות עם רזולוציה מצוינת של המורפולוגיה 8,17-24. יש לנו גם הקימו הליך שילוב פרוטוקול IEM זה עם תיוג nanogold של מערכת השמרים endosomal מלתחות 6. שימוש בגישה זו יש לי מורפולוגית מאופיינת subclasses שונה של endosomes וultrastructurally בדקה מוטנטים עם סחר endosomal פגם 6,25. יתר על כן, אנו מראים כי תיוג nanogold זה יכול להיות משולב עם labelings immunogold מתן האפשרות לחקור את ההפצה של חלבון של עניין באוכלוסיות endosome השונות. כאן אנו מציגים כיצד התיוג של מערכת השמרים endosomal עם nanogold מטען החשמלי חיובי מבוצע כמעט.
Protocol
Representative Results
Discussion
חיסוני אלקטרונים מיקרוסקופית הוא טכניקה המאפשרת שילוב של לוקליזציה של חלבונים עם הרזולוציה ultrastructural של הנשאים ואברונים שבו חלבונים אלה מתגוררים. זה חיוני במיוחד כאשר לומד את מערכת השמרים endosomal כי התאים שלה מופיעים מבני פיסוק כמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי. לכן קשה להבח…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מודים רנה Scriwanek לסיוע בהכנה של איור. FR נתמך על ידי ECHO (700.59.003), תכנית alw הפתוחה (821.02.017 ו822.02.014), שיתוף הפעולה DFG-NWO (DN82-303) וZonMW VICI (016.130.606) מענקים.
Materials
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2.6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 ̊C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 ̊C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc. , Warrington, PA | 216 | store at 4 ̊C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at 4 ̊C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35 º | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100mmx15mm petri dishe | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
Riferimenti
- Gruenberg, J. The endocytic pathway: a mosaic of domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).
- Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks. Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).
- Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. Lysosomes: fusion and function. Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Meel, E., Klumperman, J. Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system. Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).
- Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).
- Griffith, J., Reggiori, F. Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure. J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).
- Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting. Dev Cell. 3, 271-282 (2002).
- Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 9, 1060-1072 (2008).
- Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway. Traffic. 3, 37-49 (2002).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (3), 847-858 (1998).
- Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells. Traffic. 8, 471-485 (2007).
- Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry. J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).
- Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin. Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).
- Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).
- Cabrera, M., et al. Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering. J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).
- Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).
- Nair, U., et al. SNARE proteins are required for macroautophagy. Cell. 146, 290-302 (2011).
- Jacquier, N., et al. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Karanasios, E., et al. Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p. Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).
- Mari, M., et al. An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis. J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).
- Nair, U., et al. A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis. Autophagy. 8, 780-793 (2012).
- Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).
- Erpapazoglou, Z., et al. A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting. Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).
- Tuinen, E., Riezman, H. Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level. J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Morphology of the yeast endocytic pathway. Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
- Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New frontiers in gold labeling. J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).
