Nanogold Etichettatura del Sistema lievito endosomiale per le analisi ultrastrutturali
Summary
Lievito di birra, Saccharomyces cerevisiae, è stata un organismo modello chiave per identificare e studiare geni che regolano la biogenesi e le funzioni del sistema endosomal. Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per l'etichettatura specifico dei comparti endosomiali per gli studi ultrastrutturali.
Abstract
Endosomi sono uno dei principali membrana ordinamento posti di blocco nelle cellule eucariotiche e regolano il riciclaggio o la distruzione delle proteine per lo più dalla membrana plasmatica e il Golgi. Di conseguenza il sistema endosomal svolge un ruolo centrale nel mantenimento dell'omeostasi cellulare, e mutazioni in geni appartenenti a questa rete di organelli interconnessi da trasporto vescicolare, causano gravi patologie tra cui il cancro e disturbi neurobiologici. E 'quindi di primaria importanza per comprendere i meccanismi alla base della biogenesi e l'organizzazione del sistema endosomal. Il lievito Saccharomyces cerevisiae è stato fondamentale in questo compito. Per etichettare e analizzare a livello ultrastrutturale sistema endosomal di questo organismo modello specifico, presentiamo qui un protocollo dettagliato per la nanogold assorbimento carica positiva da sferoplasti seguite dalla visualizzazione di queste particelle attraverso una reazione valorizzazione argento. Questo metodo è anche un prezioso troppol per l'esame morfologico di mutanti con difetti nel traffico endosomal. Inoltre, non è solo applicabile per esami ultrastrutturali ma può anche essere combinato con etichettature immunogold delle indagini localizzazione della proteina.
Introduction
Il sistema endosomal è un importante apparato di smistamento membrana che svolge molteplici ruoli cellulari cruciali, tra cui il traffico di recettori smistamento enzima lisosomiale e il riciclaggio di membrana plasmatica (PM) recettori 1,2. Endosomi sono divisi in tre diversi comparti, vale a dire. gli endosomi precoci (EE), alla fine degli endosomi (LE) e le endosomi di riciclo. Questa classificazione si basa sul tempo impiegato materiale endocitosi raggiungerli, sulle proteine marker specifiche e sulla loro morfologia. Membrane, ovvero proteine e lipidi bistrati, interiorizzate dal PM possono sia essere consegnati ai lisosomi via endosomi per la degradazione o essere riciclati. Le membrane sono trasportati endosomi dal Golgi e similmente, sia continuare ad lisosomi o essere recuperate indietro ai Golgi. Inoltre, le proteine possono essere filtrate in vescicole luminali erba verso l'interno dalla membrana endosomal limitante, un processo che porta alla formazione diuna sottocategoria di LE, i corpi multivescicolari.
Il sistema endosomal lievito è relativamente meno complessa di quella delle cellule eucariotiche superiori. Endosomi lievito sono suddivisi in EE e LE. In contrasto con cellule di mammifero non contengono endosomi di riciclo ma anche organelli lisosomi legati tessuto-specifici. Di conseguenza, essi hanno una rete meno complessa di endosomal rotte del narcotraffico 3,4. Pertanto lievito ha rappresentato e rappresenta un sistema sperimentale vantaggiosa per studiare alcuni dei principi traffico membrana sottostante nel sistema endosomal. Questo vantaggio è accentuato dal fatto che numerosi geni coinvolti nelle vie endosomali sono stati inizialmente isolato con schermi genetici nel lievito 5. Mentre il sistema endosomiale lievito wild type e cellule mutanti è stata ampiamente studiata utilizzando approcci biochimici e di microscopia a fluorescenza, la sua indagine a livello ultrastrutturale è stato solominima. Analisi morfologiche sono particolarmente rilevanti nel lievito perché la maggior parte degli organelli endosomiali vengono rilevati come strutture puntuate mediante microscopia a fluorescenza, che rendono difficile la loro identificazione univoca 6. Purtroppo solo un numero limitato di antisieri riconoscere proteine marker lievito endosomali sta lavorando in immuno-microscopia elettronica (IEM) preparazioni 7-10. Per alcune proteine, questo problema è stato aggirato dalla codifica endogeno del gene di interesse e l'impiego di un anticorpo che riconosce il tag di rilevarla 7,11,12. Spesso, tuttavia, le proteine sono rilevabili da IEM causa dei loro livelli di espressione bassi. La loro sovraespressione non è una soluzione, perché questo approccio può indurre mis-localizzazioni e / o alterazioni nei organelli morfologia / funzioni. Così l'etichettatura dei compartimenti endocitici con una sonda rilevabile mediante microscopia elettronica EM è un'opzione efficace. Questa è una soluzione ottimale soprattutto se il prOBE sta entrando nel percorso endocitosi in modo dipendente dal tempo, che permette di conoscere quando segnerà un organello specifico 6.
L'assorbimento di nanogold carica positiva da sferoplasti lievito (vale a dire. Lievito in cui la parete cellulare è stato rimosso enzimaticamente) è stato utilizzato con successo per identificare la endosomiale lievito scomparti 10. Queste particelle si legano fortemente ai lipidi carichi negativamente che compongono le membrane biologiche. Così i soci nanogold cariche positivamente con il PM, penetra nella cellula per endocitosi e passa attraverso l'EE e LE prima di raggiungere il vacuolo. Queste piccole particelle d'oro, tuttavia, non hanno dimensioni adeguate per essere visto da EM. Per renderle visibili, le loro dimensioni possono essere allargata mediante reazioni chimiche che portano alla deposizione di argento o oro intorno alla sonda oro 13-15. Abbiamo sviluppato e applicato con successo un approccio IEM basato sul metodo Tokuyasu effettuare subcellularelocalizzazione studia 8,16. Questo metodo consente di eseguire etichettatura immunogold su preparazioni di lievito con una risoluzione eccellente della morfologia 8,17-24. Abbiamo anche stabilito una procedura che combina questo protocollo IEM con l'etichettatura nanogold del sistema lievito endosomale compartimenti 6. Usando questo approccio abbiamo morfologicamente caratterizzato diverse sottoclassi di endosomi e ultrastrutturalmente esaminato mutanti con un traffico endosomiale difetto 6,25. Inoltre, abbiamo dimostrato che questa etichettatura nanogold può essere combinato con etichettature immunogold fornendo la possibilità di esplorare la distribuzione di una proteina di interesse sulle diverse sottopopolazioni endosomi. Qui vi presentiamo come è praticamente eseguito l'etichettatura del sistema lievito endosomiale con nanogold carica positiva.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immuno-microscopia elettronica è una tecnica che permette di combinare localizzazione di proteine con la risoluzione ultrastrutturale dei vettori e organelli dove queste proteine risiedono. Ciò è particolarmente importante quando si studia il sistema lievito endosomiale perché i suoi comparti appaiono come strutture puntuate in microscopia a fluorescenza. È pertanto difficile distinguerle. Per questo motivo l'uso di una sonda rilevabile da EM e immettendo il percorso endocitosi in modo dipendente da…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano René Scriwanek per l'assistenza alla preparazione della figura. FR è sostenuto da ECHO (700.59.003), ALW programma aperto (821.02.017 e 822.02.014), la cooperazione DFG-NWO (DN82-303) e ZonMw VICI (016.130.606) sovvenzioni.
Materials
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2.6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 ̊C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 ̊C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc. , Warrington, PA | 216 | store at 4 ̊C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at 4 ̊C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35 º | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100mmx15mm petri dishe | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
Riferimenti
- Gruenberg, J. The endocytic pathway: a mosaic of domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).
- Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks. Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).
- Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. Lysosomes: fusion and function. Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Meel, E., Klumperman, J. Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system. Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).
- Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).
- Griffith, J., Reggiori, F. Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure. J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).
- Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting. Dev Cell. 3, 271-282 (2002).
- Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 9, 1060-1072 (2008).
- Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway. Traffic. 3, 37-49 (2002).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (3), 847-858 (1998).
- Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells. Traffic. 8, 471-485 (2007).
- Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry. J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).
- Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin. Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).
- Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).
- Cabrera, M., et al. Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering. J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).
- Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).
- Nair, U., et al. SNARE proteins are required for macroautophagy. Cell. 146, 290-302 (2011).
- Jacquier, N., et al. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Karanasios, E., et al. Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p. Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).
- Mari, M., et al. An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis. J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).
- Nair, U., et al. A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis. Autophagy. 8, 780-793 (2012).
- Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).
- Erpapazoglou, Z., et al. A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting. Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).
- Tuinen, E., Riezman, H. Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level. J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Morphology of the yeast endocytic pathway. Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
- Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New frontiers in gold labeling. J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).
